| تبليغات | X |
تعیین جنسیت با روشPGD
از دیرباز آدمی به این موضوع علاقه مند بوده است که جنسیت جنین را تعیین کند. در این باره، افسانهها و خرافات فراوانی نیز نقل شده است. تعيين جنسيت جنين همواره در طول ساليان سال از روياهاي دست نيافتني انسانها به شمار مي رفته، شايد براي برخي هيچ تفاوتي بين دختر يا پسر وجود نداشته، اما بدون شک براي برخي ديگر مساله اي مهم بوده است. امروزه به کمک تکنيک هاي جديد علم پزشکي، بسياري از روياها و آرزوهاي انسان ممکن شده، يکي از آنها تعيين جنسيت جنين است که در ايران نيز همپاي ساير کشورهاي پيشرفته، توانايي انجام اين کار فراهم شده است.
هم اکنون یکی از روشهای اثبات شده برای تعیین جنسیت جنین، تکنیکهای تشخیص ژنتیکی پیش از لانهگزینی میباشد. مهمترین هدف روش PGD، پیشگیری از انتقال بیماری های ژنتیکی به فرزندان والدین ناقل بیماری است. پیش از این، از روش هاي تشخيص ژنتيكي پیش از تولد به نام PND براي بررسي ناهنجاري هاي كروموزومي جنين پیش از تولد استفاده مي شد. اما در صورت تشخيص ناهنجاري در جنين، تصميم گرفتن در مورد سقط جنين براي زوج بسيار مشكل بود و صدمات جسمي و رواني را براي آنها در پي داشت. با استفاده از روش هاي تشخيص ژنتيكي پيش از لانه گزيني به نام PGD مي توان از بروز اين مشكلات جلوگيري كرد. برخی كاربردهای PGD به شرح زير است: بيماراني كه بيش از 3 بار عمل IVF يا ميكرواينجكشن انجام داده اند، اما منجر به حاملگي نشده است؛ هنگامي كه سن خانم بيش از 35 سال باشد؛ مواقعي كه ناهنجاري هاي ساختاري مانند ترانس لوكيشن (جابه جا شدن قطعات كروموزومي) در آزمايش كاريوتايپ زوجين وجود دارد؛ در سقط هاي مكرر كه عوامل ديگري براي سقط وجود نداشته است؛ تشخيص جنسيت در بيماري هايي مانند هموفيلي كه وابسته به جنس است و بروز آن به خصوص در پسران بيشتر از دختران است؛ بيماري هاي تك ژني مانند تالاسمي كه ممكن است در نوزاد بروز كند. با استفاده از PGD می توان تنها با جدا کردن یک سلول از رویان در حال رشد و انجام آزمایشات ژنتیک بر روی آن، جنین هایی را که عاری از ناهنجاری های ژنتیکی باشند، به رحم منتقل نمود و بنابراین بدون نیاز به سقط جنین که در روش های قدیمی تر لازم بود، در انتظار تولد نوزاد سالم نشست.
|
|
به طور طبيعي در مقابل هر 100 دختر، حدود 102 تا 105 پسر به دنيا مي آيد. در اين ميان اگر چه در جوامع پيشرفته تعيين جنسيت جنين اغلب موضوع مهمي نيست، اما گاهی حتي در ميان زوج های فرهیخته، علاقه به يک جنس بيشتر است. زوج هایی بوده اند که مثلا با داشتن سه يا چهار دختر در انتظار تولد يک پسر به تعداد فرزندان خود افزوده اند و نتيجه نگرفته اند. با استفاده از اين تکنيک مي توان خواسته آنها را محقق کرد و به روند افزايش جمعيت در اين خانواده ها خاتمه داد.
در ايران انجام روش تعيين جنسيت جنين پیش از تولد و همچنين تشخيص بيماري هاي ژنتيکي پيش از تولد چندين سال است که توسط مراکز درماني مختلف انجام مي شود و نوزادان فراواني به سلامت با استفاده از اين تکنيک متولد شده اند. PGD (Preimplantation Diagnosis Genetic) يا تعيين جنسيت جنين پیش از تولد هم در مورد تعيين جنسيت جنين به واسطه ی علاقه ی والدين به يک جنس خاص و هم به علت انتقال بيماري هاي ژنتيکي وابسته به جنسيت خاصي صورت مي گيرد. تشخيص ژنتیکی پيش از لانه گزيني گرچه امر جديدي است، ولي در انسان اصول کاربردهاي باليني آن در دهه گذشته پايه ريزي شده و امروزه به عنوان يک روش جايگزين براي تشخيص پيش از تولد به کار گرفته مي شود. در حال حاضر PGD تنها روش ممکن براي زوج هایی است که در معرض داشتن فرزند مبتلا به بيماري هاي ژنتيکي قرار دارند و در ضمن به دلايل قانوني، مذهبي و... نمي توانند سقط جنين را در صورت مبتلا بودن جنين به بيماري هاي ژنتيکي تجربه نمايند. در ايران اين روش بيشتر در مورد افرادي انجام شده که خواهان فرزند پسر بوده اند و تمايل زيادي به انجام اين روش براي تعيين جنسيت دختر صورت نگرفته است.
تشخيص ژنتيکي پيش از لانه گزيني يا PGD روشي است که امکان بررسي ژنتيکي جنين ها را پیش از ورود به رحم و شروع حاملگي فراهم مي سازد. بدين منظور از جنين هاي به دست آمده به روش IVF، يک يا دو سلول به عنوان نمونه برداشته مي شود و از نظر بيماري ژنتيکي خاصي مورد بررسي قرار مي گيرد. اگر سلول نمونه برداشته شده مبتلا نباشد، مي توان نتيجه گيري کرد که جنين سالم به رحم مادر منتقل مي شود تا حاملگي آغاز شود. علاوه بر استفاده از اين روش در مورد بيماري هاي ژنتيکي، در افرادي که به جنسيت خاصي علاقه دارند نيز از اين روش استفاده مي شود. به اين صورت که زوجي با داشتن مثلا چند پسر يا دختر خواهان داشتن فرزندي با جنسيتي غير از آنچه که دارند، هستند. تکنيک تشخيص ژنتيکي پیش از لانه گزینی، آخرين دست آوردها را در زمينه ژنتيک و پزشکي توليد مثلي تلفيق نموده است. در اين روش با استفاده از IVF، رویان شکل گرفته، سپس در مرحله ی 6 تا 8 سلولي يک يا دو سلول از رویان به عنوان نمونه برداشته شده و به آزمايشگاه ژنتيک ارسال مي شود. موارد استفاده از تکنيک های پيشرفته تشخيص ژنتيکي جنسيت جنين پیش از انتقال، امکان انتخاب جنسيت جنين هاي انتقالي را فراهم کرده که گامي تازه در توسعه ی تکنيک هاي تشخيص ژنتيکي پيش از انتقال جنين به شمار مي رود.
PGD در مورد زوجيني که حداقل يکي از طرفين بر اساس مطالعات فاميلي حامل يا مبتلا به يک بيماري ژنتيکي باشند و افرادي که سقط هاي مکرر داشته اند، به ویژه در افرادي که سقط ها به دليل ناهنجاري هاي ساختماني کروموزومي رخ داده باشد، مورد استفاده قرار مي گيرد. همچنين در زنان بالاي 35 سال و در زوجيني که به دليل فاکتور مردانه کانديداي ICSI (تزريق درون سيتوپلاسمي اسپرم) هستند، PGD مورد استفاده قرار مي گيرد. با استفاده از PGD مي توان از بروز بسياري از اختلالات ژنتيکي پيشگيري نمود و به اين ترتيب از صرف هزينه هاي اقتصادي و رواني و اجتماعي که تولد يک جنين با نقايص ژنتيکي به دنبال دارد پيشگيري کرد. چنانچه هدف از انجام PGD تعیین جنسیت جنین در زوج بارور باشد، ناچاريم با وجود بارور بودن زوجين از روش IVF در آنها استفاده کنيم. اهميت اين روش تنها در انتخاب جنسيت نوزاد از سوي والدين نيست، بلکه فراتر از آن مي تواند گامي در جهت دست يافتن به تکنيک هاي پيشرفته تر تشخيص ژنتيکي بيماري هاي کروموزومي پیش از انتقال جنين باشد.
روش تعيين جنسيت جنين پیش از لانه گزینی شبيه همان روش لقاح خارج رحمي و يا ميکرواينجکشن است که از اين مرحله به بعد و پیش از انتقال جنين به داخل رحم جنين هاي دلخواه در محيط آزمايشگاه تعيين و به داخل رحم انتقال داده مي شوند. براي تعيين جنسيت جنين در مرحله ی پیش از انتقال جنين به داخل رحم، در دیواره ی پیرامون جنين شکاف کوچکي ايجاد مي کنيم و با وارد کردن يک سوزن به داخل جنين يکي از سلول هاي جنين برداشته مي شود. اين مرحله از حساسيت بسيار بالايي برخوردار است و حتما بايد با مهارت و دقت بسيار بالايي صورت گيرد. گرفتن اين سلول از جنين بايد با دقت زيادي صورت گيرد تا آسيبي به جنين وارد نشود. اين سلول در شرايط خاصي تحويل متخصصين ژنتيک داده مي شود تا جنين، از لحاظ جنسيت، مورد ارزيابي ژنتيکي قرار گيرد. بعد از اين که جنسيت جنين ها توسط متخصصين جنين شناسي اعلام شد، جنين هاي با جنسيت دلخواه و جنين هاي عاري از نقايص ژنتيکي به داخل رحم انتقال داده مي شوند.
در مواردي که تعداد جنين هاي تعيين جنسيت شده زوجين زياد باشد سه تا چهار جنين به داخل رحم انتقال داده مي شود. دو هفته پس از انتقال جنين به داخل رحم فرد با انجام تست حاملگي در صورت مثبت بودن حاملگي ادامه مي يابد و فرزند دلخواه زوجين متولد خواهد شد. از زماني که روش PGD يا روش تعيين جنسيت جنين پیش از لانه گزینی براي اولين بار مطرح شده، يک دهه سپري شده است که طي اين مدت، اين تکنيک براي تعيين جنسيت جنين و تشخيص ژنتيکي بيماري هاي مختلفي به کار گرفته شده که کارايي آن را به اثبات رسانده است.
مراحل فرآیند PGD:
انجام این روش تنها در ترکیب با IVF امکان پذیر است. ابتدا با تجویز داروهایی، چندین فولیکول وادار به رشد شده و برای آزادسازی چندین تخمک آماده می گردند. سپس در زمان مناسب، تخمک ها برداشت می شوند. در آزمایشگاه IVF، اسپرم آماده شده و به تخمک ها افزوده می شود. پس از لقاح، تخمک ها که به نام رویان شناخته می شوند، مراحل رشد و تقسیم خود را آغاز می نمایند. در مرحله ی مناسبی از رشد و تقسیم، یک سلول (بلاستومر) از هر رویان جدا شده و در اختیار بخش ژنتیک قرار می گیرد. جداسازی بلاستومر از نظر تکنیکی، فرآیند دشواری است. هدف جنین شناس در اینجا، جداسازی یک سلول سالم با کمترین آسیب ممکن به بقیه ی رویان است. این کار با استفاده از میکروسکوپ ویژه ای صورت می گیرد. بلاستومر بیوپسی شده، به آزمایشگاه ژنتیک برده شده و باقیمانده ی رویان در یک محیط کشت مناسب به آنکوباتور بازگردانده می شود تا به رشد و نمو خود ادامه دهد.
ارزیابی ژنتیکی
کار آزمایشگاه ژنتیک نیز در ارزیابی تنها یک سلول برای ناهنجاری های ژنتیکی آسان نیست. به دلیل وجود تنها یک سلول برای ارزیابی ژنتیکی، نمی توان شمار ناهنجاری های مورد بررسی را خیلی گسترش داد. تنها رویان هایی که عاری از ناهنجاری ژنتیکی باشند، برای انتقال به رحم یا انجماد، انتخاب می گردند. بنابراین، رویان هایی که برای یک ناهنجاری ژنتیکی، مثبت ارزیابی شوند و نیز آنهایی که تشخیص درست در آنها مقدور نشد، به رحم منتقل نمی گردند.
ریسک فرآیند PGD
از دیدگاه بیمار، حتی پس از انجام دوره ی درمان، روش PGD و IVF ممکن است هنوز هم تضمینی برای وقوع بارداری وجود نداشته باشد. در اکثر بیماران، روش IVF می تواند منجر به تولید رویان گردد. اما پس از انتقال رویان ها به رحم، کسی نمی تواند از انجام لانه گزینی هر رویان مطمئن باشد. آمارها نشان می دهند که بیماران جوان تر شانس بیشتری برای لانه گزینی موفقیت آمیز و ادامه ی بارداری نسبت به بیماران مسن تر دارند. به طور کلی این شانس از 35 سالگی به بعد پایین می آید. البته گاهی تفاوت های فردی هم وجود دارد. بیماران باید به طور جداگانه و کامل ارزیابی گردند. در صورت استفاده از روش های IVF و PGD مزایا و محدودیت هایی وجود دارد. روشن است که بیوپسی از رویان در حال رشد می تواند منجر به عدم زنده مانی برخی رویان ها گردد. اما رویان هایی که از نظر ژنتیکی سالم تشخیص داده شوند، شانس بیشتری برای لانه گزینی و ادامه مراحل رشد و نمو خواهند داشت. همچنین این باور وجود دارد که نرخ باروری با PGD ممکن است در بیمارانی که برای شان IVF انجام شده، بالاتر باشد. زیرا زنانی که PGD برای شان انجام شده از نظر باروری مورد ارزیابی قرار می گیرند.
http://www.preimplantationgenetictesting.com/PGD_Process.htm
PGD اولین بار در دهه ی 1980 به عنوان روش جایگزینی برای تشخیص پیش از تولد و سقط احتمالی جنین مبتلا در زوج هایی که در معرض خطر بیماری های حاد ژنتیکی قرار دارند، ابداع شد. تکنیک PGD نیازمند انجام IVF است تا بتوان رویان ها را پیش از کاشت در رحم از نظر بیماری های ژنتیکی ارزیابی نمود. این کار نیاز به سقط را برطرف می کند. این فرآیند با ملاحظات اخلاقی و پزشکی همخوانی داشته و امکان انتخاب جنسیت را نیز فراهم می نماید.
نحوه ی انجام PGD:
در صورت نیاز به انجام آزمایش FISH از تکنیک استاندارد IVF استفاده می گردد. در صورت وجود اشکال در اسپرم یا نیاز به انجام PCR برای بیماری های تک ژنی، از تکنیک ICSI استفاده می شود. این کار به منظور کاهش خطر آلودگی با DNA ی اسپرم صورت می گیرد. تنها یک سلول از رویان هشت سلولی از میان شکافی که در دیواره ی محافظ بیرونی ایجاد می گردد، بیرون کشیده می شود. این مراحل در زیر میکروسکوپ بدون آسیب رساندن به قابلیت زنده مانی طبیعی و رشد و نمو جنین انجام می شود. زیرا در این مرحله هنوز هیچ یک از سلول های رویان تمایز نیافته اند. سپس این سلول جدا شده، از نظر وجود ناهنجاری های ژنتیکی ارزیابی می گردد. روش PGD با سه تکنیک ژنتیکی امکان پذیر است: FISH، PCR و هاپلوتایپ.
با این تکنیک می توان کروموزوم های خاصی را با استفاده از پروب های فلورسنتی که برای هر کروموزوم اختصاصی هستند، ارزیابی نمود. پروب های نشان دار به کروموزوم ها متصل شده و زیر میکروسکوپ فلورسنت مرئی می گردند. در حال حاضر، با این تکنیک می توان حداکثر تا پنج کروموزوم (X، Y، 13، 18 و 21) را به طور همزمان در یک سلول تکی مورد ارزیابی قرار داد. در مورد بیماری های پیوسته به جنس نیز می توان از این تکنیک برای تعیین جنسیت و ناهنجاری های کروموزومی عددی و ساختاری مثلا غربالگری آنیوپلوییدی استفاده کرد.
این تکنیک امکان تکثیر قطعات انتخابی DNA ی استخراج شده از هسته را به منظور شناسایی وقوع جهش در یک ژن خاص فراهم می نماید. معمولا طی یک روز می توان به تشخیص نهایی دست یافته و تنها رویان هایی که سالم تشخیص داده شوند، در روز چهارم یا پنجم به رحم منتقل می شوند.
این تکنیک در سال 2006 ابداع شد. در اینجا از انگشت نگاری DNA به منظور شناسایی کروموزوم هایی که ژن های بیماری زا را حمل می کنند، استفاده می گردد.
PGD برای چه کسانی توصیه می شود؟
زوج هایی که سابقه ی بیماری ژنتیکی داشته اند، باید پیش از آغاز فرآیند PGD، مشاوره ی ژنتیکی دریافت نمایند. آنها باید از گزینه های جایگزین موجود از جمله PND، سقط جنین در صورت مثبت بودن آزمایش، اهدای گامت یا در نهایت قبول فرزندخوانده، آگاه گردند. همچنین باید در مورد خطرات تشخیص اشتباه احتمالی نیز مورد مشاوره قرار گیرند. متاسفانه، برای زنان مسن تر و زنانی که سطح پایه ی FSH شان بالاست، PGD می تواند به علت نرخ پایین تر بارداری گزینه ی خوبی باشد. این افراد ممکن است حتی قادر به تولید شمار مناسب رویان برای انجام این آزمایش هم نباشند. تا به امروز در سراسر دنیا حدود 1000 نوزاد با استفاده از PGD متولد شده اند. تاکنون هیچ گونه گزارشی از افزایش ناهنجاری های جنینی به دنبال PGD وجود نداشت است. توجه به این نکته هم بسیار مهم است که احتمال دارد که هیچ یک از رویان های آزمایش شده سالم نبوده و برای انتقال به رحم مناسب نباشند. از این گذشته، همانند همه ی آزمایشات دیگر، در اینجا نیز احتمال گرفتن نتایج مثبت کاذب و منفی کاذب نیز وجود دارد (به ترتیب 1 به 6 و 1 به 50). علت این امر ناهمگنی کروموزوم ها از یک سلول به سلول دیگر (موزاییسیزم) بوده و بنابراین سلول گرفته شده برای بیوپسی ممکن است نماینده ی خوبی از بقیه ی سلول های رویان نباشد. بنابراین، توصیه می شود که زنان با ریسک بالا در طی دوران بارداری (در حدود هفته های 11 تا 16) برای ناهنجاری های کروموزومی مورد آزمایش قرار گیرند. مراکز کمی خدمات PGD را ارایه می دهند. کاربرد روش PGD در حال افزایش بوده و اندیکاسیون های آن در حال گسترش است. جدول زیر مثال هایی از بیماری های ژنتیکی است که می توان با روش PGD تشخیص داد.
غربالگری ژنتیکی پیش از لانه گزینی که به نام غربالگری آنیوپلوییدی نیز شناخته می شود، شامل غربالگری رویان ها با استفاده از روش FISH برای آنیوپلوییدی های رایج (کروموزوم 21، 18، 16 و 13) است. آنیوپلوییدی وضعیتی است که در آن تعداد کروموزوم در هر سلول رویان اشتباه است. سپس تنها رویان های سالم که تعداد کروموزوم شان طبیعی است برای انتقال به رحم انتخاب می گردند. در زنان مسن تر که وقوع ناهنجاری های کروموزومی از قبیل سندروم داون 7 تا 70 برابر افزایش می یابد، زنانی که سابقه ی سقط مکرر جنین یا عدم موفقیت مکرر در IVF دارند (در حالی که رویان های با کیفیت خوبی داشته اند)، از این تکنیک به منظور افزایش نرخ تولد با IVF استفاده می گردد.
بازدهی روش های PGD و PGS به دو عامل بستگی دارد: تعداد رویان های در دسترس برای بیوپسی که با افزایش سن زن کاهش می یابد؛ و بیماری های ژنتیکی، زیرا تعداد رویان های سالم قابل انتقال به رحم به وجود بیماری ژنتیکی بستگی دارد.
تعیین جنسیت
بله، سرانجام امکان تعیین جنسیت فرزند آینده تان 96 ساعت پس از لقاح فراهم شد.
http://aftab.ir/news/2008/dec/03/c4c1228309898_social_health_therapy_ministry_of_health.php
http://www.ghatreh.com/news/2672197.html
http://www.photo.isna.ir/ISNA/NewsView.aspx?ID=News-1247245&Lang=P
http://www.pezeshk.us/?p=14502
http://www.magiran.com/npview.asp?ID=1762556
http://gilan.isna.ir/mainnews.php?ID=News-54455
http://www.pezeshk.us/?p=5133
http://www.pezeshk.us/?p=7363
http://www.pezeshk.us/?p=3534
http://fattahi.net/amozesh/modules/news/article.php?storyid=477
منتظر خبرهای بعدی باشید.
کراک چیست و چه می کند؟
رضا پورسیفی
كوكايين، آلكالوئيد اصلي برگ كوكا است كه از برگهاي بوته اي به نام (Ergthroxglom Coca) بدست مي آيد، كه مركز اصلي رويش آن آمريكاي جنوبي است. كوكايين به عنوان ماده موثر در سالهاي 60- 1859 م. از برگ كوكا مجزا و استحصال شد. كراك را نيز از كوكايين تهيه و اولین بار در اواخر تابستان 1985 به بازار شهر نيويورك عرضه كردند. كراك خطرناكترين ماده اعتياد آوري است كه تا كنون به بازار آمده و به حدي وابستگي آور است كه يك بار مصرف آن، فرد را معتاد مي كند. از نظر طبقه بندي فارماكولوژي، محرك سيستم اعصاب مركزي است.
كوكايين پودر سفيد نرم شفاف كريستالي با طعمي تلخ است كه اغلب با پودر تالك، يا ملين ها يا شكر مخلوط مي شود و معمولا به صورت استنشاق، تزريقي، خوراكي يا دود كردن و گاهي هم به طريق پاشيدن روي دستگاه تناسلي مصرف مي كنند. دود معمولي آن براي انفيه و استنشاق 30 تا 100 ميلي گرم است و 10 تا 25 ميلي گرم آن براي تزريق استفاده مي گردد. كوكايين بي حس كننده موضعي است و به ندرت براي برخي از اعمال جراحي استفاده مي شود.
|
|
|
|
پودر کوکائين |
کراک |
نامهاي خياباني آن Coke مخفف كلمه كوكايين (Cocaine)، Candy (آب نبات کوکایین) ، Nose (بيني) ،Snow (برف) ، Happy (شادی آوری) و Dust (مواد گردي، گرد و خاك) مي باشد. استعمال كوكا، قرنهاست در كشورهاي هند، پرو و بوليوي معمول بوده، برگهاي كوكا را براي لذت و خوش بودن مي جوند، مردم اين كشورها براي قادر شدن به انجام كارهاي سخت و تحمل گرسنگي و تشنگي از جويدن كوكا ياري مي گيرند. تا آنجا كه به تاريخچه كوكا مربوط مي شود، اين عادت در ميان ساكنان كوه هاي آند رايج بوده است. در تابوت هاي باستاني هوآکاس (Huacas) در پرو، مجسمه هاي در حال استعمال كوكا كشف شده اند.
ساختار شیمیایی
متامفتامین یکی از اعضای گروه فن اتیل آمین هاست که شامل طیفی از مواد است که می توانند محرک بوده entactogens یا hallucinogens باشند. بنابراین متامفتامین، در واقع، ان، آلفا-دی متیل فن اتیل آمین (N,α-dimethylphenethylamine) است. بر اساس آیوپاک، نام سیستماتیک کامل آن، ان، آلفا- دی متیل بنز اتان آمین است. اتم کربن نامتقارن آلفا سبب ایجاد دو انانتیومر می گردد. این دو شکل تا پیش از این استرئوایزومر – یا ال و استرئوایزومر + یا دی نامگذاری شده بودند. اما در تقسیم بندی جدید با نام های استرئوایزومر های آر و اس نامیده می شوند.
ساختار مولکولی
فرمول مولکولی: C10H15N وزن مولکولی: 2/149
اثرات كوتاه مدت:
اثرات كوتاه مدت آن مشابه آمفتامين است ولي با مدت زمان كوتاهتر، احساس افزايش انرژي، چابكي و سرخوشي زياد مي كند، از جمله اثرات آن پس از مصرف عبارت است از: افزايش ضربان قلب، نبض، تنفس، درجه حرارت بدن، فشار خون، گشادگي مردمك چشم، پريدگي رنگ، كاهش اشتها، تعرق شديد، تحريك و هيجان، بي قراري، لرزش به خصوص در دستها، توهمات شديد حسي، عدم هماهنگي حركات، اغتشاش دماغي، گيجي، درد پا، فشار قفسه سينه، تهوع، تيرگي بينايي، تب، اسپاسم عضله، تشنج و مرگ.
در حالت قطع ماده نيز افسردگي شديد حادث مي شود. ناخالصي كوكايين خيابان اغلب موجب حساسيت و آلرژي شديد مي شود كه معمولا با آب ريزش بيني و بي خوابي شديد همراه است. در مسموميت حاد با كوكايين، فرد مصرف كننده دچار بي قراري و تشويش، هيجان، شوريدگي فكر و اختلال تنفسي مي گردد. ضربان، تنفس و فشار خون فرد افزايش مي يابد.
اثرات دراز مدت:
از جمله اثرات بلند مدت آن از دست دادن وزن بدن، يبوست، بي خواب، ضعف جنسي، دپرسيون تنفسي، اشكال در ادرار كردن، تهوع، كم خوني، رنگ پريدگي، تعرق شديد، دردهاي شكمي و اسهال، اختلالات در هضم و دستگاه گوارشي، سردرد، لرزش دست ها، لرزش و تشنج، پريدن عضلات و سفتي آنها، هپاتيت، آب ريزش دائمي بيني، ايجاد زخم، آماس و جوشهاي پوستي به خصوص اطراف مخاط گوش و بيني، زخم مخاط بيني (در مصرف به صورت انفيه)، اضطراب، بي قراري، تشنج پذيري شديد، سوء ظن، گيجي، اختلالات درك زمان و مكان، رفتار تهاجمي، تحريك پذيري شديد، افسردگي، پرخاشگري، تمايل به خود كشي، توهمات و اختلال در حواس (به خصوص بينايي، شنوايي، و لامسه)، افكار هذياني، و گاهي اشتهاي كاذب و سرانجام ناراحتي جدي دماغي و رواني به نام سايكوز و كوكايين. تحمل و ايجاد وابستگي كوكايين مشابه آمفتامين است وابستگي شديد رواني ايجاد مي كند كه اين وابستگي در عصاره كوكايين يعني كراك شديدتر مي باشد. در آزمايشاتي كه براي تحقيق پيرامون اثر كوكايين بر روي موش و ميمون انجام شده، پس از قطع مصرف آن، نشانه هاي ترك از جمله ضعف شديد، بدخوابي، افسردگي، تحريك پذيري، گرسنگي شدید ديده شده است. روشن ترين علامتي كه بر چهره معتادان كوكا ديده مي شود فرو رفتگي گونه هاست كه در اثر مكيدن برگ كوكا به وجود مي آيد.
مصرف كننده، كراك را چه به طريق استنشاق يا پاشيدن روي توتون و ماري جوانا و چه از راه كشيدن با پيپ استعمال كند، ديگر نمي تواند از مصرف آن خودداري كند و بايد پي در پي آن را استعمال نمايد. خيلي سريع جذب ريه گشته و به مغز مي رسد و حالت تهاجمي به مصرف كننده دست داده، باعث بزرگ شدن قلب، افزايش فشار خون مي شود، به گونه اي شديدتر از كراك پديدار مي گردد. اصولا فردي كه كراك مصرف مي كند، ديگر بر خود تسلط ندارد و گويا خودي خود را گم كرده است.
این ماده یک ماده سنتتیک (مصنوعی) بوده، معمولاً به شکل پودر سفیدی است که به عنوان یک محرک سیستم عصبی مرکزی (CNS) عمل می کند. اولین بار در ژاپن در سال 1919 متامفتامین کاربرد درمانی محدودی داشت. اما عمدتاً در آزمایشگاه های کلندشتاین به ویژه در ایالات متحده آمریکا و خاور دور تهیه شد.
شکل فیزیکی
پایه اصلی مت آمفتامین یک چربی فرار بی رنگ نامحلول در آب است. معمول ترین ترکیبات نمکی آن هیدروکلراید است که به صورت یک پودر سفید، زرد مایل به سفید یا خاکستری مایل به سفید یا به صورت کریستال های محلول در آب یافت می شود. فرآورده های غیرقانونی آن عمدتاً به شکل پودر است. اما کریستال های خالص هیدروکلراید آن با نام یخ (ice) شناخته می شود. قرص های دارای مت آمفتامین ممکن است دارای لوگو هایی شبیه به MDMA و سایر قرص های اکستازی باشند.
فارماکولوژی
مت آمفتامین یک محرک سیستم عصبی مرکزی است که سبب افزایش فشار خون، افزایش ضربان قلب همراه با احساس افزایش انرژی، چابکی و سرخوشی می شود. همچنین سبب کاهش اشتها و خستگی شده و منجر به بی خوابی می گردد. به دنبال مصرف خوراکی آن، معمولاً اثرات مصرف آن طی 30 دقیقه آغاز شده و ساعت ها به طول می انجامد. سپس فرد احساس تندخویی و پرخاشگری، بی خوابی، اضطراب، افسردگی و بی حالی می کند. این ماده میزان فعالیت سیستم های غیرآدرینرژیک و ناقلین عصبی دوپامین را افزایش می دهد. مت آمفتامین اثراتی قوی تر از آمفتامین دارد. اما در شرایط کنترل نشده، اثرات آن تقریباً قابل تشخیص از اثرات آمفتامین نیست. ایزومر- اسِ آن فعالیت بیشتری از ایزومر- آر دارد. دوز درمانی ایزومر- اس حداکثر 25 میلی گرم به صورت خوراکی است. این ماده پس از مصرف خوراکی به سرعت جذب شده و حداکثر سطوح پلاسمایی آن در دامنه 001/0 تا 005/0 میلی گرم در لیتر می رسد. نیمه عمر پلاسمایی این ماده در حدود 9 ساعت است. متابولیت های اصلی شامل 4- هیدروکسی مت آمفتامین و آمفتامین هستند.
مرگ و میر در اثر مصرف مت آمفتامین به طور مستقیم به ندرت گزارش شده است. در اکثر مسمومیت های کشنده غلضت خونی این ماده بیش از 5/0 میلی گرم در لیتر است. آنالیز متامفتامین در ادرار پیچیده و مشکل است زیرا این ماده متابولیت فرآورده های دارویی خاصی (به عنوان مثال سلجیلین) است. مسمومیت حاد سبب اختلالات شدید قلبی- عروقی و نیز ناهنجاری های رفتاری شامل اضطراب، گیجی، ناآرامی، بی اختیاری و پرخاشگری می شود. مصرف دراز مدت مت آمفتامین سبب تغییرات عصبی- شیمیایی و عصبی – آناتومیکی می گردد. اعتیاد به این ماده سبب از بین رفتن حافظه، قدرت تصمیم گیری و صحبت کردن می شود. برخی علایم همانند علایم اسکیزوفرنیای روانی می باشد. این اثرات و عوارض می توانند تا مدتها پس از ترک این ماده نیز باقی بمانند. اگرچه اغلب این علایم بالاخره برطرف می گردند. تزریق مت آمفتامین همان خطراتی (به عنوان مثال ایدز و هپاتیت) که تزریق سایر مواد مخدر تزریقی مثل هرویین دارند را دارا می باشد. در صورت مصرف دود مت آمفتامین، این ماده بسیار سریع تر به مغز می رسد. مواد مخدری که به صورت دود مصرف می شوند (مثل مت آمفتامین، کراک و کوکایین) بسیار اعتیاد آور تر و خطرناک تر از هنگامیست که به صورت خوراکی مصرف شوند.
روش های تهیه و ساخت کراک
انانتیومر-اس عمدتاً از طریق احیای ال- افدرین یا از طریق احیای دی- پزودوافدرین تولید می گردد. هم افدرین و هم پزودوافدرین به طور تجاری در دسترس بوده و در فرآورده های دارویی خاصی به کار رفته اند. همچنین افدرین را می توان از گیاه افدریا وولگاریس (که در طب چینی به نام ماهوآنگ به کار می رود) استخراج نمود.
روش مصرف
مصرف مت آمفتامین اغلب به صورت خوراکی و تنفسی بوده و کمتر به صورت تزریقی یا دود کردن می باشد. برخلاف ترکیب نمکی سولفات آمفتامین، مت آمفتامین هیدروکلراید، به ویژه شکل کریستالی (یخ) به قدر کافی فرار هستند که قابل دودکردن باشند. در صورت مصرف خوراکی، یک دوز از این ماده ممکن است از ده ها تا صدها میلی گرم از ماده موثر مت آمفتامین را بسته به میزان خلوص و ترکیب ایزومری آن، داشته باشد.
با استفاده از کروماتوگرافی گازی می توان مقادیر کمتر از 10 میکروگرم از این ماده را در لیتر در ادرار فرد مصرف کننده شناسایی نمود.
مقادیر خلوص رایج
میزان خلوص پودرها معمولاً کمتر از 10 درصد است. قرص ها ممکن است حداکثر تا 40 میلی گرم از فرم فعال این ماده را داشته باشند. اما میزان خلوص این ماده در فرم های نمک کریستالی هیدروکلراید مت آمفتامین بین 5 تا 80 درصد متغیر بوده و میانگین آن حدود 40 تا 50 درصد است. در اروپا رایج ترین موادی که جهت تقلب در خلوص این ماده استفاده می شوند، عبارتند از کافئین، گلوکز و سایر قندها و در مقادیر کمتر افدرین و کتامین.
مت آمفتامین، به خصوص در آمریکای شمالی و کشورهای خاور دور، شایع ترین ماده مخدر اعتیاد آور سنتتیک است. در میان کشورهای اروپایی، مت آمفتامین بیشترین مصرف را در جمهوری چک، اسلوواکی و نیز در برخی زیرجمعیت های مجارستان دارد. اگرچه این ماده در بسیاری از کشورهای دیگر و از جمله کشور ما نیز یافت می شود.
تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت رحم
لوکا جیانارولو، ام. کریستینا ماگلی، آنا پی. فرارتی
احتمال انتقال بیماری های ژنتیکی به فرزندان یکی از مشکلات عمده اکثر زوجهایی است که می خواهند صاحب فرزند شوند. میزان این ریسک با ارزیابی تاریخچه خانوادگی یا سن مادر و انجام تشخیص پیش از تولد در زوج هایی که در مقایسه با جمعیت پایه ریسک بالاتری دارند شدیداً کاهش یافته است. روش جایگزینی که در کنار تکنولوژی کمکی تولیدمثلی (ART) در دسترس است، روش تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت در رحم (PGD) است که با استفاده از آن می توان پیش از انتقال رویان به رحم مادر بیماری های ژنتیکی را غربالگری نمود. ایده PGD در اوایل دهه 1960 که تلاش هایی برای تعیین جنسیت رویان های خرگوش در مرحله بلاستوسیست انجام شد، به وجود آمد (1). این اتفاق حتی پیش از ظهور تکنیک های لقاح آزمایشگاهی (IVF) در طب تولیدمثل انسانی رخ داد (2). در سالهای پس از آن، ادغام این دو تکنیک امکان استفاده از PGD به عنوان روش جدیدی برای پیشگیری از بیماری های ژنتیکی را فراهم نمود. PGD را می توان در دو نوع شرایط به کار گرفت: این روش برای زوج هایی با ریسک داشتن فرزندی با بیماری های ژنتیکی تک – ژنی، از جمله سیستیک فیبروزیس یا انواع تالاسمی توصیه می شود؛ یا می توان آن را برای غربالگری بیماری های کروموزومی، چه عددی (آنیوپلوییدی) و چه ساختاری (معکوس شدگی ها یا جابه جایی ها) انجام داد. PGD در طب تولیدمثل به خصوص برای شناسایی عوامل ژنتیکی مرتبط با ناباروری کاربرد دارد. به علاوه تشخیص پس از آنالیز کروموزومی در رویان های یوپلویید و انتقال انتخابی آنها اثر مثبتی روی بازده کلینیکی مشاهده شده در بیماران با ریسک داشتن رویان های آنیوپلوییدی دارد. شاید این به واسطه این واقعیت باشد که ناهنجاری های کروموزومی یکی از عوامل اصلی ایجاد سقط های خود به خودی و شاید موارد ناموفق کاشت رویان در رحم باشد. بیش تحریکی تخمدان و IVF برای تهیه رویان های آزمایشگاهی متعدد ضروریست تا بتوان از این بین رویان های سالم را انتخاب نمود. معمولاً یک یا دو سلول به منظور آنالیز ژنتیکی در دسترس قرار دارد. این سلول ها از رویان های سه روزه یا از تروفوبلاست های حاصل از بلاستوسیست های گسترش یافته جدا می شوند (کاربرد بالینی نمونه برداری بلاسیست هنوز در دست بررسی بوده و بنابراین در این مقاله مروری به آن پرداخته نمی شود). از طرف دیگر اجسام قطبی را نیز می توان از اووسیت ها جدا کرده و برای بررسی بیماری هایی با منشا مادری مورد استفاده قرار داد. در هر یک از این موارد، روش تشخیصی مورد استفاده باید به اندازه کافی حساس باشد تا بتوان از آن برای مقادیر بسیار اندک DNA استفاده کرد و نیز برای به دست آوردن نتایجی با بیشترین میزان تکرارپذیری مناسب باشد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به منظور شناسایی ناهنجاری های تک ژنی روش مناسبی است. به منظور دوری گزیدن از DNA با منشا خارجی و اطمینان از این که هر دو آلل طی واکنش تکثیر شده اند، استراتژی های خاصی به کار می رود. آنالیز تعداد کروموزوم های اینترفاز بر پایه پروب های DNA نشان دار شده با مواد فلورسنس خاصی در تکنیک دورگه سازی درجای DNA با پروب های فلورسنس استوار است. استفاده از پروب های چندتایی (مالتیپلکس) امکان غربالگری همزمان چندین کروموزوم را فراهم نموده و می توان با پروب های مختلف دورهای موفق FISH را تکمیل نمود. اولین کاربردهای بالینی PGD در سال 1990 (3 و 4) با اولین آبستنی های به دست آمده پس از نمونه گیری از بلاستومر و تعیین جنسیت با PCR در زوج هایی بوده است که در ریسک بالایی از داشتن فرزند مبتلا به بیماری های وابسته به کروموزوم X بوده اند (3). از آن به بعد، صدها سیکل PGD انجام شده است که گرایش رو به رشدی را برای این روش نشان می دهد. حتی در زوج های بارور و سالمی که به منظور امکان استفاده از PGD با انجام IVF موافقت می نمایند. لیست بیماری هایی که PGD برای تشخیص آنها به کار رفته است، به سرعت در حال افزایش است. به طور نظری، برای هر نوع بیماری که توالی ژنی آن در دسترس باشد می توان از PGD استفاده کرد. این اطلاعات برای طراحی پرایمرهای مورد نیاز برای تکثیر انتخابی آن ناحیه از DNA که در آن جهش روی داده، ضروریست. به طور مشابه، از روش FISH به منظور غربالگری آنیوپلوییدی ها و ناهنجاری های ساختاری کروموزوم ها از قبیل جابه جایی ها می توان استفاده کرد. مزایای این روش ها با توجه به افزایش میزان استفاده از آنها و در عین حال کاهش نرخ بروز سقط های خودبه خودی مرتبط با زنده مانی بهتر رویان های یوپلویید مشخص می گردد (5 و 6). بنابراین نه تنها PGD روش جایگزینی برای روش های پیشین مدیریت ناهنجاری های رویان که منجر به خاتمه دادن درمانی بارداری که پیش از این شکل گرفته می شدند، بلکه روشی است که راندمان فرآیند ART را به حداکثر می رساند. طی چند سال اخیر تأکید خاصی بر به حداکثر رساندن راندمان ارزیابی نمونه تک سلول صورت گرفته است. استراتژی هایی با هدف شناسایی و حذف منابع خطا و تشخیص نادرست طی روش های PCR و FISH طراحی شده است. به این ترتیب می توان تعریفی از بهترین شرایط و مقیاس های نمره دهی را ارایه داد که بالاترین میزان دقت و تکرارپذیری را برای PGD فراهم نماید. پیشرفته ترین دستاوردهای روز PGD در نشستی که کارگروه بین المللی ژنتیک پیش از کاشت طی سومین سمپوزیوم بین المللی ژنتیک پیش از کاشت در بولونیا در سال 2000 برگزار شد، گزارش گردید (7). در آن زمان، در سراسر جهان، بیش از 2500 چرخه PGD انجام شده بود که منجر به تقریباً 600 مورد آبستنی بالینی (24%) و تولد حدود 500 نوزاد گردیده است. هفت مورد ناسازگاری بین PGD و ژنوتایپ/کاریوتایپ جنین مربوطه گزارش شده که سبب شد میزان دقت به مقدار 98.2% برسد. ارزیابی کامل 236 نوزاد اولی که پس از انجام PGD متولد شدند، در مجموع 11 مورد بدریختی و نقص مادرزادی (4.7%) به دنبال داشته است. این رویداد با فراوانی نقایص مشاهده شده در جمعیت پایه قابل مقایسه است (7 و 8). یک مقاله مروری فراگیر که از روی نتایج حاصل از 1318 چرخه PGD توسط کنسرسیوم PGD موسسه ESHRE منتشر شده است (8).
شناسایی مشکلات و محدودیت های تکنیک ها، پروتوکل ها و روش ها
در PGD، روش های تشخیصی، بر پایه تکنولوژی DNA است. برای تشخیص جهش های تک ژنی مرتبط با بیماری های تک ژنی اکثراً از روش PCR استفاده می شود. در حالی که برای غربالگری آنیوپلوییدی و ناهنجاری های کروموزومی ساختاری از روش FISH استفاده می گردد. صرف نظر از نوع آنالیز ژنتیکی مورد نیاز، روش های به کار رفته جهت نمونه گیری از اووسیت یا رویان و مواد مورد استفاده در PGD، مشابه است. فرآیند نمونه گیری مستلزم دستکاری میکروسکوپی است. به برچسب زدن درست و واضح ظروف به کار رفته در نمونه گیری و کشت باید توجه خاصی نمود تا از ارتباط صحیح بین سلول نمونه گیری شده و اووسیت یا رویانی که نمونه از آن گرفته شده مطمئن شویم. یک نکته کلی این است که یک روش ارزیابی دقیق بلوغ و کیفیت اووسیت – ظهور پیش هسته ها و اجسام قطبی – و یک ارزیابی ریخت شناختی از وضعیت نمو رویان برای انتخاب مناسب مواد مورد استفاد در آنالیز ژنتیکی بسیار ضروریست (9 و 10). بنابراین یک روش ارزیابی دقیق و حرفه ای در هر مرحله ای از مورفولوژی و تکامل اووسیت برای به دست آوردن بهترین نتایج ضروریست (11).
نمونه گیری از اجسام قطبی
بخش عمده اووسیت های به دست آمده پس از القای رشد فولیکولی چندتایی در مرحله متافاز II، از طریق حضور اولین جسم قطبی (PB1) مشخص می گردد که معمولاً 36 تا 40 ساعت پس از تزریق hCG به بیرون رانده می شود. PB1 فرآورده فرعی اولین تقسیم میوز بوده و شامل بخشی از کروموزوم های اووسیت است که در این مرحله، دیپلویید است. باروری به دست آمده پس از آن، تعداد کروموزوم های درون اووسیت، با بیرون راندن یک سری 23 کروموزومی در دومین جسم قطبی (PB1) کاهش می یابد. ارزیابی دومین اجسام قطبی برای به دست آوردن تشخیص ژنتیکی خوب ضروریست. در مورد PGD برای بیماری های تک ژنی، اجسام قطبی اول و دوم (PB1 و PB2) باید پشت سر هم جدا شده و به منظور ارزیابی کراسینگ اوور احتمالی بین کروموزوم های هومولوگ طی میوز، به طور جداگانه مورد ارزیابی قرار گیرند. به منظور غربالگری آنیوپلوییدی، هر دو نوع اجسام قطبی، را می توان به طور همزمان جدا کرد و تداخل بین نتایج آنها را بر پایه این واقعیت که PB1 دیپلویید و PB2 هاپپلویید است، استوار است (9).
نمونه گیری از جسم قطبی اول (PB1)
جدا کردن PB1 از طریق دستکاری میکروسکوپی اووسیت تقریباً چهار ساعت پس از جمع آوری اووسیت ها انجام می شود. در این زمان، PB1 معمولاً از غشای تخمک (oolemma) کنده می شود. اووسیت با یک پیپت نگهدارنده، حفظ شده که در این حالت جسم قطبی در موقعیت ساعت شش یا دوازده قرار دارد. با استفاد ه از یک سوزن شیشه ای شکاف کوچکی در زونا پلوسیدا باز شده و جسم قطبی با یک پیپت شیشه ای باریک و شفاف مکیده می شود. طی اولین ساعت، تلقیح اسپرم به اووسیت، از طریق تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) با استفاده از سرنگ میکروسکوپی از راه شکافی که در زونا پلوسیدا باز شده است، انجام می شود. ICSI نه تنها برای کاهش ریسک آلودگی DNA اسپرم توصیه می شود، بلکه به منظور دوری گزیدن از بروز پلی اسپرمی که در اثر شکاف باز شده در زونا پلوسیدا ایجاد شده، نیز انجام می شود. نمونه گیری از جسم قطبی اول PB1 اثر نامطلوبی بر باروری یا تسهیم تخم ندارد. این روش به ویژه در مورد جابه جایی هایی که در تخمک زن روی داده و با آزمایش FISH با رنگ آمیزی کروموزوم تشخیص داده می شود، سودمند است.
نمونه گیری از جسم قطبی دوم (PB2)
PB2 با فرستادن یک پیپت مکنده به درون شکاف ایجاد شده، جدا می شود. این مرحله بسیار حساس و ظریف است. زیرا ممکن است هنوز ارتباطی بین PB2 غشای تخمک باقی مانده باشد. سپس تخمک هایی که مورد نمونه برداری قرار گرفته اند، به ظروف کشت برگردانده شده و تا زمان چک کردن تسهیم آنکوبه می شوند.
نمونه گیری از اجسام قطبی اول و دوم (PB1, PB2)
جدا کردن همزمان اجسام قطبی اول و دوم نیازمند تکنیکی مشابه آنچه برای نمونه گیری از جسم قطبی اول توضیح داده شد، می باشد. این استراتژی زمان به کار رفته و استرس وارد شده در اثر فرآیند دستکاری میکروسکوپی را کاهش داده و نمونه گیری و آنالیزهای ژنتیکی را تنها به اووسیت های بارور شده سالم محدود می نماید. با این حال، هنوز ملاحظاتی درباره تغییرات دژنراتیو مشاهده شده در PB1 در زمان کنترل لقاح باقی مانده است. در نتیجه با انجام نمونه برداری از اجسام قطبی رویان دست نخورده باقی می ماند. زیرا تنها فرآورده های فرعی میوز به منظور آنالیز ژنتیکی اووسیت به کار رفته اند. در مواردی که انجام PGD امکان پذیر نیست، نیز می توان از این روش استفاده کرد. البته در اینجا ناهنجاری های با منشا پدری و آنهایی را که پس از انجام لقاح یا اولین تقسیمات رویان به وجود آمدند، نمی توان شناسایی کرد.
نمونه برداری از بلاستومر
معمولاً 62 تا 64 ساعت پس از تلقیح، از یک یا دو بلاستومر، نمونه برداری انجام می شود. این محدودیت زمانی به واسطه این واقعیت است که در این زمان فشردگی رویان روی می دهد. چنانچه این مراحل هنگامی انجام شوند که برهمکنش های سلول – سلول و ارتباطات سلولی آغاز شده باشند، احتمال بروز آسیب های سلولی بالاست. از طرف دیگر، رویان ها را می توان در یک محیط کشت با کمبود یک کاتیون دو ظرفیتی شستشو داد تا اتصالات محکم بین سلولی و حالت چسبندگی بین سلول ها از بین برود. فرآیند نمونه برداری شامل باز کردن شکافی در لایه زونا پلوسیدا با قطر تقریبی 20 تا 25 میکرومتر است. برای این کار سه راه مختلف پیشنهاد می گردد.
مکانیکی
به منظور ایجاد شکاف در لایه زونا پلوسیدا از سوزن میکروسکوپی شیشه ای استفاده می گردد. در این روش یک شکاف مثلثی V شکل یا یک دریچه مربع شکل ایجاد می شود (9). این روش وقت گیر بوده و نیازمند یک اوپراتور ماهر است.
شیمیایی
پس از برداشتن محلول تایرود اسیدی (با pH برابر 2.35) در یک پیپت با قطر 12 میلیمتر، بلاستومر های انتخاب شده برای نمونه برداری در موقعیت ساعت 3 قرار می گیرد. لبه بیرونی بلاستومر مورد فوکوس میکروسکوپ قرار گرفته و پیپت به سرعت در تا نزدیکی رویان پایین آورده می شود. فوکوس میکروسکوپ را با بلاستومر مورد نظر و نوک پیپت حاوی محلول اسیدی تنظیم کرده و محلول اسیدی با توجه به موقعیت بلاستومر مورد نظر، در نقطه ای روی زونا پلوسیدا ریخته می شود. هنگامی شکاف باز شد، مقادیر اضافی محلول اسیدی موجود در محیط کشت در نزدیکی رویان با استفاده از همان پیپت محلول اسیدی مکیده می شود. از این روش بیشتر استفاده می گردد (8).
لیزر تماسی
یک میکرودریل غیر تماسی برای ایجاد یک شکاف در لایه زونا پلوسیدا مورد استفاده قرار گرفته و نیازی به جدا کردن رویان ها از محیط کشت نخواهد بود (14). این روش اگرچه خیلی سریع و دقیق است، اما هنوز داده های کافی برای مناسب بودن این روش برای اووسیت و رویان های انسانی در دسترس نیست تا کاربرد آن را فراگیرتر سازد. هنگام باز کردن شکاف در زونا پلوسیدا، موقعیت رویان به نحوی تنظیم می گردد تا یک بلاستومر هسته دار در موقعیت ساعت سه قرار گیرد. حضور یک هسته برای آنالیز DNA ضروری است. متأسفانه هسته ها همیشه قابل مشاهده نبوده و در این مورد، انتخاب بلاستومر عمدتاً بر اساس اندازه اش و ظاهر سیتوپلاسمی اش است تا شانس برداشتن نمونه های بدون هسته کاهش یابد. یک پیپت شیشه ای با قطر 30 تا 40 میکرومتر تا نزدیکی شکاف زونا پلوسیدا آورده می شود. فوکوس میکروسکوپ بر روی لبه بیرونی بلاستومر و نوک پیپتی که بلاستومر را می مکد تنظیم می گردد. با استفاده از مکیدن بسیار ملایم، بلاستومر به آهستگی به درون پیپت هدایت شده و سپس در محیط کشت رها می گردد. به منظور دوری گزیدن از ایجاد پارگی و آسیب به سلول نمونه برداری شده و همچنین به بلاستومرهای دیگر، به دقت بسیار بالایی نیاز است. پس از تهیه نمونه، رویان را به دقت شسته، در محیط کشت تازه ای قرار داده و تا زمان انتقال در آنکوباتور گذاشته می شود. سلول های نمونه برداری شده در ظروف ویژه دستکاری میکروسکوپی در دمای اتاق گذاشته می شود. در نتیجه، PGD با بلاستومر، به واسطه امکان غربالگری بیماری های با منشا مادری و پدری و نیز بیماری های که پس از لقاح به وجود می آیند، دارای ارجحیت است. اگرچه توده سلولی رویان کاهش می یابد، هیچگونه اثرات زیان بخشی برای زنده مانی رویان گزارش نشده است (15). در واقع، داده هایی از نتایج بالینی رویان های نمونه برداری شده، نشان داده اند که تقریباً یک چهارم این رویان ها را می توان در رحم کاشت (5). از سویی دیگر، موزایسم که به نظر می رسد در رویان هایی که در شرایط آزمایشگاهی تهیه شده اند، یک حالت عادی باشد، می تواند نشان دهنده یک محدودیت موجود در تشخیص ژنتیکی در مرحله تسهیم باشد. این مشکل احتمالاً در مورد نمونه برداری از بلاستوسیست نیز باقی خواهد ماند (16 و 17).
آنالیز کروموزومی
سلولهای به دست آمده از نمونه برداری که در بالا شرح داده شد را در محلول هیپوتونیک قرار داده، با متانول و اسید استیک گلاسیال روی اسلاید شیشه ای فیکس کرده، در غلظت های افزایشی اتانول آبگیری نموده و طبق پروتوکول دورگه سازی آن را آنکوبه می نمایند.
انجام فرآیند تثبیت برای به دست آوردن تشخیص نهایی درست، حیاتی است.
رایج ترین مشکلات عبارتند از:
پس از آبگیری از هسته های تثبیت شده، پروب های نشان دار با فلورسنس افزوده می گردد تا بتوان روش FISH مالتیپلکس با چند رنگ را انجام داد. توجه به این موارد الزامیست:
یک واسرشت سازی همزمان پروب های DNA و DNA نمونه در دمای 68 تا 73 درجه سانتیگراد به مدت سه تا پنج دقیقه انجام می شود ( این شرایط بسته به مخلوط پروب های به کار رفته و پروتوکل مورد اجرا در هر آزمایشگاهی شدیداً متفاوت است).
اتصال مجدد رشته های DNA و تشکیل دورگه ها پس از آنکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد به مدت دست کم سه ساعت در مورد بلاستومرها انجام می گیرد، اما برای اجسام قطبی آنکوباسیون طولانی تری لازم است. در پایان واکنش، پروب های اضافی (متصل نشده یا متصل شده ی غیر اختصاصی) با شستشو در دماهای بالا (71 تا 73 درجه سانتیگراد) در محلول نمکی برداشته می شود. پس از رنگ آمیزی با رنگ های متضاد در محلول کدورت زدا، سیگنال های فلورسنت با بزرگنمایی 600 برابر با میکروسکوپ فلورسنس نمره دهی می شوند. برای تفسیر سیگنال های فلورسنت، استانداردهایی تعریف شده است (9 و 19). دورگه سازی دوباره همان سلول نمونه برداری شده با پروب های اضافی در دور بعدی FISH بسیار مهم است. زیرا این کار، اطلاعات به دست آمده را به تعداد بیشتری از کروموزوم ها گسترش می دهد (20). گرفتن سیگنال های فلورسنت روی یک سیستم آنالیز تصویر کامپیوتری نه تنها به ذخیره آن کمک می کند، بلکه برای تفسیر و مرور سیگنال های تشخیص داده شده نیز سودمند است. رایج ترین منابع خطا طی این مراحل کاری، از دست رفتن ریزهستک ها، همپوشانی سیگنال ها روی هم، خرابی دورگه سازی، استانداردهای نامناسب نمره دهی برای تفسیر سیگنال های جدا از هم و موزاییسم است. به منظور دوری گزیدن از خطاهی تکنیکی مرتبط با تثبیت کروماتین، دورگه سازی و تفسیر سیگنال های درست، اقدامات احتیاطی خاصی انجام می گیرد. موزاییسم هنوز به عنوان یک منبع خطای تشخیص نادرست مطرح است؛ اما آنالیز همزمان چندین کروموزوم در شناسایی ناهنجاری های پیچیده بسیار سودمند است (21). جدیدترین گزارش درباره دقت نتایج حاصل از FISH در نمونه های تک سلول حدود 97% است (7).
آنالیز ژنتیکی برای بیماری های تک ژنی
پس از کامل شدن فرآیند نمونه برداری، سلول جدا شده را در زیر استریوسکوپ به درون یک تیوب میکروسنتریفیوژ حاوی بافر تجزیه منتقل می کنند. سپس با استفاده از رایج ترین روش ها مثل تیمار با پروتئیناز K یا هیدروکسید پتاسیم به اضافه دی تیوتریتول عمل تجزیه سلول انجام میگرد. مشکل عمده PCR احتمال آلودگی با DNA با منشا خارجی است که منشا اصلی آن اغلب مادری (سلول های کومولوس) یا پدری (سلول اسپرم) است. همچنین منشا این DNA خارجی ممکن است خود کارکنان آزمایشگاه باشند. در هر دو آزمایشگاه باید مراقبت های خاصی انجام گیرد. زیرا شرایط استریل استاندارد برای پیشگیری از آلودگی DNA کافی نیست.
در آزمایشگاه IVF:
· تمامی مواد یک بار مصرف، محیط های کشت و روغن های به کار رفته در کشت و دستکاری میکروسکوپی در موارد PGD باید از بسته های استریل و باز نشده تهیه گردند؛
· در همه مراحل نیاز به دستکش ها، ماسک ها و گان های استریل است؛
· ابزارهای دستکاری میکروسکوپی را پیش از استفاده در برابر تابش ماورای بنفش قرار می گیرند؛ و
· در زمان نمونه برداری، تنها دو جنین شناس که مشغول کارند، مجازند در آزمایشگاه رفت و آمد کنند تا جریان هوای ناشی از حرکت افراد به حداقل برسد.
در آزمایشگاه ژنتیک:
· برای PCR و PGD اتاق هایی اختصاصی، جداگانه و کاملاً مجهز باید در نظر گرفته شود.
· طی انجام آنالیز و مراحل آماده سازی، دسترسی به آزمایشگاه PCR، باید محدود گردد.
· باز کردن تیوب های حاوی نمونه و مواد آزمایشی باید به حداقل ممکن کاهش یابد؛ و
· یک روز پیش از استفاده از مواد آزمایشی، باید تمامی آنها را با انجام یک PCR شاهد، از نظر آلودگی DNA ارزیابی نمود تا وجود احتمالی DNA انسانی در آنها تشخیص داده شود.
به منظور تفسیر نتایج، علاوه بر شاهد مثبت، یک سری شاهد منفی نیز طی واکنش انجام می شود تا حضور DNA خارجی را در محیط کشت اووسیت یا رویان نشان دهد. به علاوه مارکرهای چندشکل به عنوان روش کمکی دیگری برای شناسایی DNA خارجی هستند. برای آنالیز فرآورده های PCR روشهای مختلفی به کار می رود که تشکیل هترودوبلکس و هضم با آنزیم های برشی رایج ترین آنهاست (22 و 23). یک روش جایگزین، PCR فلورسنت (F-PCR) است که در آن پرایمرهای نشاندار با مواد فلورسنس به کار می رود. در این مورد، فرآورده های تکثیر روی یک آشکارساز فلورسنس که در مقایسه با سیستم ژل استاندارد بسیار حساس تر است، ارزیابی می گردد. F-PCR به ویژه برای تشخیص موتاسیون های نقطه ای که توالی یابی مستقیم فرآورده های PCR ضروریست، بسیار سودمند است (24). تفسیر درست نتایج PCR ممکن است در اثر مشکل تکثیر ترجیحی یک آلل بر دیگری یا ADO (کنارگذاشتن یک آلل) خدشه دار شود. این پدیده به PCR با تک سلول محدود نمی شود. اما در اینجا، پیامدها شدیدتر بوده و می تواند منجر به تکمیل نتایج اشتباه گردد. استراتژی هایی برای شناسایی ADO تعریف شده است. کارآمدترین اینها، منحصر به آن تعریفی از مارکرهای چندشکل است که به شدت به ژن مورد مطالعه پیوسته است (7). این مارکرها معمولاً شامل تکرارهای کوتاه پشت سرهم (STRs) که توالی های کوتاهی، 2 تا 5 جفت باز به ازای هر واحد تکراری هستند که در سراسر ژنوم انسان پراکنده اند و عمدتاً در نواحی بین ژنی واقع شده اند. STR ها با ژنی که به شدت به آن پیوسته اند، در یک واکنش PCR مالتیپلکس با حضور چندین پرایمر در یک مخلوط تکثیر، به طور همزمان تکثیر می شوند. F-PCR تکنیک انتخابی برای تکثیر همزمان ژن مورد مطالعه و مارکرهای پیوسته حاوی اطلاعات مربوطه است. اگر دو یا چند مارکر حاوی اطلاعات برای جهش مورد نظر در دسترس باشد، عمده ADO ها شناسایی شده و منجر به افزایش دقت تا حد 97 درصد می گردد (9 و 25).
بایدها و نبایدها برای PGD
کاربرد PGD لزوماً نیازمند تکنیک های ART بوده و حتی زوج های بارور و سالم باید تمامی مراحل مربوط به تیمارهای ART، از جمله القای رشد فولیکول های چندتایی، برداشت اووسیت در ساعات 34 تا 36 پس از تزریق hCG و تلقیح آزمایشگاهی اووسیت ها، باید رویشان انجام شود. به عنوان یک توصیه عمومی، برای شناسایی جنین های دارای ناهنجاری مورد نظر، چندین جنین لازم است. بنابراین یک پاسخ مناسب به بیش تحریکی، الزام مهمی است. به خصوص هنگامی که جنین ها نه تنها بر اساس آنالیز ژنتیکی شان منتقل می شوند، بلکه بر اساس مورفولوژی شان نیز باشد. این روش، دقت انتخاب جنین را بالا می برد. زیرا نتایج PGD یک استاندارد انتخاب اضافی را نیز دربرمی گیرد. چنانچه بروز بیماری در جنین 25 درصد تخمین زده شود، در مورد بیماری های تک ژنی با توارث مندلی، فراوانی عدم تعادل کروموزومی به درصدهای بالاتری در گروه های بیماران انتخاب شده خواهد رسید (26). در این موارد، نرخ آبستنی نشان داده است که به طور مستقیم به تعداد اووسیت تولید شده مرتبط بوده و در نتیجه کیفیت پاسخ به بیش تحریکی فولیکولی فاکتوری برای موفقیت در سیکل PGD خواهد بود (27). برخی تکنیک های پیشرفته تر کمکی تولیدمثل ART موجب افزایش چشمگیری در راندمان PGD شده اند. با استفاده از ICSI به عنوان تکنیک تلقیح، راندمان تولیدمثل بهبود یافته و لذا ریسک آلودگی DNA اسپرمی به حداقل رسیده است. به علاوه، انجماد رویان، به ویژه هنگامی که در مرحله دو پیش هسته ای انجام شود، امکان زمان بندی انتقال رویان را فراهم می نماید. نتایج گزارش شده در دهه ی پیش نشان می دهد که PGD گزینه با ارزشی برای زوج های با ریسک بالای تولیدمثلی شده است. لیستی از بیماری هایی که برای تشخیص آنها می توان از PGD استفاده کرد، به سرعت در حال افزایش است. در مورد تشخیص آنیوپلوییدی، به منظور انتخاب مجموعه ای از پروب ها برای کروموزوم های مربوطه، انجام کاریوتایپ از خون محیطی والدین ضروریست. در بیمارانی که سن مادرشان بالاست، معمولاً این انتخاب شامل کروموزوم هایی است که آنیوپلوییدی شان در سقط های خود به خودی و تولدهای زنده، رایج تر است، از جمله کروموزوم های X، Y، 13، 16، 18، 21 و 22. پروب های اضافی را نیز می توان برای تشخیص کروموزوم های دیگری که خطاهایشان ممکن است اثری بر کاشت رویان در رحم داشته باشد، در اینجا استفاده کرد. نتایج به دست آمده می تواند اطلاعات مفیدی درباره نقش تک کروموزوم ها در کاشت موفق رویان در رحم در اختیار قرار دهد. به طور نظری این امکان وجود دارد که آنیوپلوییدی های این کروموزوم ها که به نظر می رسد اهمیت بالینی داشته باشند، چنان اثرات زیان بخشی دارند که به واسطه ی نقصی اولیه در نمو رویان، لانه گزینی رویان در رحم هرگز روی نخواهد داد. هنگامی که یکی یا هر دوی والدین حامل یک کاریوتایپ تغییر یافته از قبیل یک جابجایی متعادل باشند، انتخاب پروب ها باید شامل این پروب های اختصاصی برای ناهنجاری مربوطه باشد. در مورد جابه جایی های دوطرفه، ترکیب مناسبی از پروب های تلومری و سانترومری که برای بیماری مورد مطالعه اختصاصی هستند باید شناسایی گردند. تست های اولیه پروب های انتخاب شده از لمفوسیت های فرد حامل برای تأیید کارایی این سیستم توصیه می گردد. انجام PGD برای ناهنجاری های تک ژنی، یک مرحله آماده سازی طولانی را دربرمی گیرد که با تخمین موتاسیون های تشخیص داده شده در لمفوسیت های زوجین آغاز می گردد. تمامی ناهنجاری های تک ژنی، در اصل، با PGD قابل تشخیص است، به شرطی که ناحیه رمز کننده مربوطه توالی یابی شده باشد و موتاسیون آن شناسایی شده باشد. این مرحله برای طراحی و ساخت اکثر پرایمرهای مناسب ضروریست. آزمایش PCR برای هر بیماری خاص، باید طراحی گردد و باید توجه نمود که به نحوی باشد که مارکرهای چندشکل پیوسته به بیماری را دربرگفته و حاوی اطلاعات مفید (در صورت وجود) بوده به نحوی که وجود آلودگی DNA خارجی و وقوع ADO در آن قابل شناسایی باشد. هنگامی که پروتوکل PCR تکمیل شده و روش PGD برای بیماری مورد مطالعه قابل اجرا به نظر رسید، تمامی مواد مورد استفاده باید از جهت عاری بودن از DNA ارزیابی شوند. هیچگونه منعی برای انجام PGD وجود ندارد. مگر در مواردی که به رشد چندتایی فولیکولی از طریق بیش تحریکی یا شروع بارداری ارتباط دارد. همه زوج های با ریسک بالای تولیدمثلی می توانند PGD را بدون توجه به وضعیت باروری شان، به عنوان مثال، حامل های بارور ناهنجاری های تک ژنی به عنوان جایگزین سقط درمانی در نظر گیرند. برای PGD در آنیوپلوییدی ملاحظات متفاوتی مورد نیاز است که هدف آن افزایش شانس لانه گزینی رویان در رحم از طریق دوری گزیدن از انتقال رویان های دارای آنیوپلوییدی یا ناهنجاری های کروموزومی ساختاری است. حامل های جابه جایی های دوطرفه اغلب بارور بوده اما پیش آگهی بسیار ضعیفی از آن دارند به طوری که جدا شدن نامتعادل با نرخ بسیار بالایی روی می دهد. انتخاب رویان هایی با کاریوتایپ طبیعی یا متعادل می تواند پیش آگهی ضعیف مرتبط با این وضعیت را تخفیف دهد که با وقوع بالای سقط های خودبه خودی مشخص می گردد (12).
آمادگی بیماران
استفاده از PGD در دهه گذشته افزایش در خور توجهی داشته است. بررسی داده های جمع آوری شده امکان شناسایی گروه های مختلف بیمارانی که در آنها انجام PGD ضروریست، فراهم گردیده است.
ناهنجاری های کروموزومی
ناهنجاری های کروموزومی عددی با شکست در کاشت رویان در رحم و نرخ بالای مرگ و میر رویان در ارتباط است. آنیوپلوییدی عمدتاً از جدانشدن کروموزوم طی گامتوژنز ایجاد شده و با افزایش سن مادر به طور قابل ملاحظه ای افزایش می یابد (28). جدا نشدن کروموزوم ها می تواند پس از لقاح نیز روی دهد که منجر به تشکیل رویان های موزاییک گردد که در این موارد بلاستومر های نرمال، مونوزومی و تریزومی می توانند همزمان با هم در ترکیبی از ناهنجاری های پیچیده تر وجود داشته باشند (29). اکثر موارد آنیوپلوییدی در ارتباط با نقص در کاشت رویان در رحم یا سقط خود به خودی هستند. اگر چه برخی از آنها (به عنوان مثال تریزومی 13، 18، 21 و آنیوپلوییدی کروموزوم های جنسی) قادر به گسترش مفهوم این اصطلاح اند. تمامی ناهنجاری های کروموزومی حتی آنها که پیچیده ترند، در توده سلولی درونی بلاستوسیست های انسانی شناسایی گردیده اند (16 و 17). این یافته ها نشان می دهند که معیارهای مورفولوژیک از قبیل تکامل بلاستوسیست به تنهایی، برای تأیید انتخاب رویان های یوپلویید و زنده مان کافی نیستند. چنانچه در نشست کارگروه بین المللی ژنتیک پیش از لانه گزینی گزارش شد، بیش از 1500 چرخه PGD در سراسر جهان انجام شده که منجر به حدود 400 بارداری گردیده است (7). گروه های بیماران اشاره شده در زیر بررسی شده اند:
سن مادر 36 سال یا بیشتر
بر اساس مهمترین مطالعات انجام شده، درصد رویان های با ناهنجاری های کروموزومی در مواردی که سن مادر 36 سال یا بیشتر است، تقریباً 65 درصد بوده که این میزان با افزایش سن مادر افزایش می یابد. دستاورد مهمی در راندمان بالینی به دست آمده پس از انجام PGD، افزایش نرخ لانه گزینی و کاهش فراوانی سقط های خود به خودی بوده است (5 و6). این به خصوص در مورد زنان با سن بالای 42 سال که شانس بارداری شان پس از PGD همانند زنان جوان تر باشد، درست است (30). در سنین بالاتر، شاید عوامل دیگری نیز در کاهش نرخ موفقیت نقش دارند.
زوج های با بیش از سه بار شکست در IVF
میزان بروز شکست های IVF توضیح داده نشده ی چندگانه در بیماران جوان شاید به واسطه اثر ترکیبی عوامل زیادی باشد. فراوانی ناهنجاری های کروموزومی در این گروه بیماران به بیش از 55 درصد می رسد؛ اما انتخاب آنهایی که مکمل یوپلوییدی دارند، بهبودی در پیش آگهی بالینی ایجاد نمی کند و نرخ بارداری پس از FISH مشابه گروه شاهد بوده است (5). هاپلوییدی، پلی پلوییدی و ناهنجاری های پیچیده، فراوان ترین ناهنجاری های کروموزومی شناخته شده اند. این یافته ها نشان می دهند که احتمالاً تقسیمات میتوزی تغییر یافته به ناهنجاری های سانتریولی مرتبط بوده که نشان دهنده منشا این خطاهاست (13). از طرف دیگر، کروموزومهای دیگری در کنار این کروموزوم های غربال شده نقش مهمی در زنده مانی رویان ها دارند (26 و 32).
کاریوتایپ تغییر یافته به واسطه موزاییسم کروموزومی یا جابه جایی های متعادل
شکست های فراوان در لانه گزینی و میزان بروز بالای سقط به میزان قابل ملاحظه ای با انتقال رویان های یوپلویید کاهش می یابد (5). در این گروه های بیماران، فراوانی رویان های با ناهنجاری کروموزومی 62 درصد و رویان های با مونوزومی و تریزومی 46 درصد از ناهنجاری ها را تشکیل می دهد. به خصوص به نظر می رسد که حامل های جابه جایی متعادل، رویان های نامتعادلی را به وجود می آورند (تقریباً 80 درصد). چنانچه تعداد قابل قبولی از رویان های طبیعی یا متعادل قابل شناسایی باشد، نرخ بالاتری از نتایج لانه گزینی حاصل از رویان های انتخاب شده با FISH به دست می آید (12).
اسپرم تهیه شده از اپیدیدمیس یا بیضه با بیش از یک بار شکست در IVF
درصد بسیار بالایی از رویان های با ناهنجاری کروموزومی (72 درصد) در این گروه بیماران به دست آمده است (33). انتقال رویان های انتخاب شده با PGD منجر به نرخ بارداری بالینی 25 درصد با نرخ لانه گزینی 18.8 درصد می شود. این راندمان بالینی همانند نتایجی که در بیماران با شکست های مکرر در IVF مشاهده شده، است. اما شاید عوامل ایجاد این پیش آگهی ضعیف، چنانچه از نوع ناهنجاری های مشاهده شده به نظر می آید، متفاوت باشد. به نحوی که 45 درصد به واسطه مونوزومی و تریزومی بوده و جالب توجه این که 8.6 درصد از رویان های دارای ناهنجاری، آنیوپلوییدی های گونوزومی نشان می دهند. مشارکت مرد نیز در اتیولوژی این تغییرات، امکان پذیر است.
سقط های مکرر
داده های اولیه درباره این وضعیت نرخ بالایی (68 درصد) از رویان های با ناهنجاری کروموزومی را نشان می دهند (30). اگرچه نتایج اولیه درباره نرخ تولدهای زنده، امیدوارکننده است، اما به منظور ارزیابی ارزش روش PGD پیشنهادی برای آنیوپلوییدی در این گروه بیماران، داده های بیشتر و مطالعات مقایسه ای ضروریست (34).
ناهنجاری های تک ژنی
در حال حاضر، حدود 750 چرخه PGD برای ناهنجاری های تک ژنی در سراسر جهان انجام شده که حدود 150 مورد بارداری و بیش از 100 مورد تولد نوزاد سالم در پی داشته است (7). PGD برای 26 ناهنجاری گزارش شده و لیست این بیماری ها به سرعت در حال افزایش است. به خصوص کاربردهای این روش برای جهش های دینامیک از قبیل سندرم X شکننده، بیماری هانتینگتون و دیستروفی ماهیچه ای بسیار نوآورانه است که با گسترش کلاس تکرار های تری نوکلئوتیدی که در درون نواحی رمزگردان و ترجمه نشده ژن ها قرار دارد، مرتبط است (35، 36 و 37). استفاده از مارکرهای مالتیپلکس قابلیت اعتماد این روش تشخیص را به میزان قابل توجهی افزایش داده است. به منظور کاهش ریسک تشخیص اشتباه، به ویژه در مورد جهش های حاوی اطلاعات کم یا بدون اطلاعات، روشهای ابداعی جدیدی در دست بررسی و بازنگری است. برای اینگونه بیماری ها، نگرانی ویژه ای درباره اطلاعات داده شده به بیمارانی که از وضعیت خود آگاه نیستند (به عنوان مثال بیماری هانتینگتون) در حال افزایش است. گزارش شده که زمینه ژنتیکی برای بیماری های دیررس دلیل مناسبی برای انجام PGD است (7). افراد حامل جهش ژن سرکوبگر تومور p35، در ریسک بالاتری از زمینه ارثی سرطان به سر می برند. به منظور انتخاب رویان های عاری از این نوع جهش می توان از PGD استفاده کرد. این که آیا وجود یک زمینه ژنتیکی برای بیماری های سخت می تواند معیاری برای انتقال رویان های انتخاب شده و سالم تشخیص داده شده، باشد یا خیر، جای بحث دارد. انجام PGD برای جور شدن HLA امکان بارداری را در جایی که نوزاد ممکن است یک دهنده احتمالی پیوند برای برادر یا خواهر مبتلایش باشد که نیاز به پیوند مغز استخوان دارد، فراهم می نماید. با روش های آنالیز ژنتیکی می توان از بین رویان های سالمی که هاپلوتایپ شان با کودک بیمار جور می شود، انتخاب نمود (7). در نتیجه روش PGD برای بیماری های تک ژنی، نه تنها تکنیکی برای آغاز یک بارداری سالم است، بلکه یک روش عمومی برای پیشگیری و درمان بیماری های ژنتیکی نیز هست.
ارزیابی سود- خطر
نمونه گیری از اووسیت و رویان، روش های تهاجم بوده و با توجه به تکامل و زنده مانی رویان پس از انجام نمونه گیری، نگرانی هایی وجود دارند. آزمایشات نشان داده اند که نمونه گیری در مرحله هشت سلولی هیچگونه اثرات زیان بخشی بر رشد و تکامل بعدی رویان ندارد (15). مهمتر این که داده های بالینی به دست آمده از رویان های نمونه گیری شده، نشان می دهد که تقریباً یک چهارم از آنها را می توان در رحم کاشت (5). تشخیص بیماری های ژنتیکی مبتنی بر آنالیز تک سلول مستلزم انجام تکنولوژی شدیداً پیچیده و مراقبت های ویژه ایست تا دقت این روش را بیشینه نماید. به منظور ارزیابی کارآیی این روش، مراقبت های ویژه ای اعمال شده است. پیشرفت های چشمگیری در شناسایی عوامل احتمالی تشخیص اشتباه، از جمله تعریف راهنماهایی برای آزمایشگاه های ART هنگام کار با موارد PGD ارایه شده است (38). در مورد PGD برای آنیوپلوییدی، کنترلی برای کیفیت نتایج به دست آمده با تکرار نمونه گیری از رویان های منتقل نشده و انجام FISH روی بلاستومرهای به دست آمده انجام می شود (19، 20 و 39). نتایج، راندمان آزمایشگاهی 97 درصدی را نشان می دهد که با راندمان آزمایشات in vivo (97.8 درصد) تطابق دارد. راندمان آزمایشات in vivo از طریق داده های به دست آمده از تشخیص پیش از تولد بارداری های به وجود آمده یا ارزیابی مستقیم نوزادان در هنگام تولد محاسبه می گردد (7). مقادیر مشابهی از PGD برای بیماری های تک ژنی گزارش شده است (7 و 9). اعمال مراقبت های ویژه برای پیشگیری از آلودگی با DNA خارجی و ADO، عوامل اصلی تشخیص اشتباه را شدیداً محدود نموده است. در سراسر جهان، تنها شمار اندکی، تشخیص های اشتباه گزارش شده (کارگروه بین امللی ژنتیک پیش از لانه گزینی در سال 2001، تنها هفت مورد تشخیص اشتباه را گزارش نموده است)؛ این تعداد، PGD را به عنوان روشی ایمن و قابل اعتماد مطرح می سازد. با وجود این نتایج، هنوز هم لازم است که روش های رایج تشخیص پیش از تولد، به بیماران توصیه گردد تا بتوان نتایج به دست آمده از PGD را با کمک روش های آمنیوسنتز یا نمونه گیری از پرزهای کریونی (CVS) تأیید نمود. اخیراً، PGD برای آنیوپلوییدی، معیار بسیار محکمی برا انتخاب رویان های زنده مان شناخته می گردد. در این مورد، نرخ خالص بالاتر تولد پس از انجام PGD برای آنیوپلوییدی (5 و 6) نشان می دهد که هزینه یک چرخه درمان موفق با PGD ارزان تر از همان تعداد چرخه ART است که برای یک تولد زنده مورد نیاز است. از طرف دیگر، اکثر بیماران بارور که تصمیم دارند به PGD تن دردهند، آنهایی هستند که یا با سقط درمانی به شدت مخالفت می کنند یا کسانی که از پیش تجربه پایان دادن به بارداری با جنین بیمار را دارند. متأسفانه، نگرانی های اصلی موجود، تنش همراه این روش، نرخ حاملگی نسبتاً پایین و هزینه مالی بالا هستند. اینها به ویژه برای کشورهایی درست است که با وجود مزایای زیاد این روش برای اکثر زوج های مایل به داشتن فرزندی سالم، قصد ندارند فن آوری های کمکی تولید مثل (ART) از جمله روش های PGD را راه اندازی نمایند. همیشه گفته شده که پیشگیری از بیماری های ژنتیکی بسیار ارزان تر بوده تنها هزینه پشتیبانی از این فن آوری، مستلزم انجام تشخیص ژنتیکی است.
نتایج
پس از گذشت ده سال از ابداع PGD در پزشکی تولیدمثل و انجام تقریباً 2500 چرخه PGD، نتایج اصلی به دست آمده بدین ترتیب است که PGD روشی معتبر برای پیشگیری از تولد فرزندان بیمار بوده و این که می تواند جایگزینی برای سقط درمانی باشد. PGD برای آنیوپلوییدی، سودمند بوده و هنگامی که در گروه هایی از والدین انتخاب شده به کار رفت، منجر به افزایش نرخ خالص تولد نوزاد زنده گردید. با وجود راندمان بالای این تکنیک، هنوز هم روش های رایج تشخیص پیش تولد توصیه می گردد.
References
1. Gardner RL, Edwards RG. Control of the sex ratio at full term in the rabbit by transferring sexed blastocysts. Nature (London), 1968, 218:346–348.
2. Steptoe PC, Edwards RG. Birth after reimplantation of a human embryo. Lancet, 1978, 2:366.
3. Handyside AH et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature (London), 1990, 344:768–770.
4. Verlinsky Y et al. Analysis of the first polar body: preconception genetic diagnosis. Human Reproduction, 1990, 5:826–829.
5. Gianaroli L et al. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed. Fertility and Sterility, 1999, 72:837–844.
6. Munné S et al. Positive outcome after preimplantation diagnosis of human embryos. Human Reproduction, 1999, 14:2191–2199.
7. International Working Group on Preimplantation Genetics. 10th Anniversary of Preimplantation Genetic Diagnosis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2001, 18:66–72.
8. ESHRE PGD Consortium Steering Committee. ESHRE preimplantation genetic diagnosis (PGD) consortium: data collection II (May 2000). Human Reproduction, 2000, 15:2673–2683.
9. Verlinsky Y, Kuliev A. An atlas of preimplantation genetic diagnosis. London, The Parthenon Publishing Group, 2000.
10. Magli MC et al. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology, 2001, 183:29–34.
11. Gianaroli L e t a l. Atlas of embryology. Human Reproduction, 2000, 15 (Suppl. 4), Oxford University Press.
12. Munné S et al. Outcome of preimplantation genetic diagnosis of translocations. Fertility and Sterility, 2000, 73:1209–1218.
13. Dumoulin JC et al. Effect of Ca2+/Mg2+-free medium on the biopsy procedure for preimplantation genetic diagnosis and further development of human embryos. Human Reproduction, 1998, 13:2880–2883.
14. Germond M et al. Improved fertilisation and implantation rate after non-touch zona pellucida microdrilling of mouse oocytes with a 1.48 mm diode laser beam. Human Reproduction, 1996, 11:1043–1048.
15. Hardy K et al. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8-cell stage. Human Reproduction, 1990, 5:708–714.
16. Evsikov S, Verlinsky Y. Mosaicism in inner cell mass of human blastocysts. Human Reproduction, 1998, 13:3151–3155.
17. Magli MC et al. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro. Human Reproduction, 2000, 15:1781–1786.
18. Munné S et al. Reduction in signal overlap results in increased FISH efficiency: implications for preimplantation genetic diagnosis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1996, 13:149–156.
19. Munné S et al. Scoring criteria for preimplantation genetic diagnosis of numerical abnormalities for chromosomes X, Y, 13, 16, 18, and 21. Molecular Human Reproduction, 1998, 4:863–870.
20. Gianaroli L et al. Advantages of day four embryo transfer in patients undergoing preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1996, 16:170–175.
21. Delhanty JDA et al. Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients. Human Genetics, 1997, 99:755–760.
22. Handyside AH et al. Birth of a normal girl after in vitro fertilisation and preimplantation diagnostic testing for cystic fibrosis. New England Journal of Medicine, 1992, 327:905–910.
23. Kuliev A et al. Preimplantation diagnosis for thalassemias. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1998, 15:253–257.
24. Findlay I, Quirke P. Fluorescent polymerase chain reaction: Part I. A new method allowing genetic diagnosis and DNA fingerprinting of single cells. Human Reproduction Update, 1996, 2:137–152.
25. Rechitsky S et al. Accuracy of preimplantation diagnosis of single-gene disorders by polar body analysis of oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1999, 16:192–198.
26. Gianaroli L et al. Will preimplantation genetic diagnosis assist patients with a poor prognosis to achieve pregnancy? Human Reproduction, 1997, 12:1762–1767.
27. Gianaroli L et al. Gonadal activity and chromosomal constitution of in vitro generated embryos. Molecular and Cellular Endocrinology, 2000b, 161:111–116.
28. Munné S et al. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosomal abnormalities. Fertility and Sterility, 1995, 64: 382–391.
29. Delhanty JD, Handyside A. The origin of genetic defects in the human and their detection in the preimplantation embryo. Human Reproduction Update, 1995, 1:201–215.
30. Gianaroli L et al. Aneuploidy detection in ART. 10th International Congress on Prenatal Diagnosis and Therapy, Barcelona, 19–21 June, 2000.
31. Sathanathan H et al. The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos. Human Reproduction, 1996, 11:345–356.
32. Bahçe M et al. PGD of aneuploidy: were we looking at the wrong chromosomes? Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1999, 16:176–181.
33. Gianaroli L et al. Preimplantation diagnosis after assisted reproduction techniques for genetically determined male infertility. Journal of Endocrinological Investigation, 2000, 23:711–716.
34. Simon C et al. Increased chromosomal abnormalities in human preimplantation embryos after in vitro fertilisation in patients with recurrent miscarriage. Reproduction Fertility and Development, 1998, 10:87– 92.
35. Sermon K et al. Clinical application of preimplantation diagnosis for myotonic dystrophy. Prenatal Diagnosis, 1997, 17:925–932.
36. Sermon K e t a l. Preimplantation diagnosis for Huntington’s disease (HD): clinical application and analysis of the HD expansion in affected embryos. Prenatal Diagnosis, 1998, 18:1427–1436.
37. Sermon K et al. Preimplantation diagnosis for Fragile- X syndrome based on the detection of the nonexpanded paternal and maternal CGG. Prenatal Diagnosis, 1999, 19:1223–1230.
38. Gianaroli L et al. Guidelines for good practice in IVF laboratories. Human Reproduction, 2000, 15:2241– 2246.
39. Magli MC e t a l. Incidence of chromosomal abnormalities from a morphologically normal cohort of embryos in poor prognosis patients. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1998, 15:297–301.
http://www.cdc.gov/genomics/hugenet/default.htm
http://genes-r-us.uthscsa.edu/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/
http://jamesline.com/patientsandvisitors/prevention/cancergenetics/
http://www.nursing.uiowa.edu/areas/parentchild/cdrom.htm
http://www.esp.org/foundations/genetics/classical
http://gslc.genetics.utah.edu/
http://www.genome.gov/10000409
http://www.geneticfairness.org/
http://www.familyvillage.wisc.edu/index.htmlx
http://www.geneticalliance.org/
http://www.genome.gov/Pages/EducationKit/
http://www.nsgc.org/consumer/familytree/index.cfm
http://www4.umdnj.edu/camlbweb/teachgen.html
http://www.cancer.gov/cancertopics/UnderstandingCancer/genetesting
http://aappolicy.aappublications.org/
http://www.nih.gov/sigs/bioethics/
http://dnapatents.georgetown.edu
http://www.ornl.gov/hgmis/elsi/elsi.html
http://www.genome.gov/10001754
http://www.geneticmedicine.org/
http://www.genethics.ca/index.html
http://www.sph.umich.edu/genpolicy/
http://www.humgen.umontreal.ca/en/
http://www.georgetown.edu/research/nrcbl/nirehg/index.htm
http://www.ncsl.org/programs/health/genetics.htm
http://www.georgetown.edu/research/nrcbl/nirehg/scope.htm
http://ehrweb.aaas.org/ehr/books/index.html
http://www.ama-assn.org/ama/pub/category/2380.html
http://www.cyrillicsoftware.com
http://www.hhs.gov/familyhistory/
http://www.ensembl.org/Data/blast.html
http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/
http://compbio.ornl.gov/channel/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/
http://www.bwhct.nhs.uk/genetics-cemg-home.htm
http://www.medicine.man.ac.uk/GenEd/
http://www.marchofdimes.com/gyponline/index.bm2
http://iml.dartmouth.edu/education/cme/Genetics/
http://www.acmg.net/resources/cd-rom-01/intro.asp
http://genes-r-us.uthscsa.edu/resources/genetics/primary_care.htm
http://www.apa.org/science/genetics/homepage.html
http://www.cincinnatichildrens.org/ed/clinical/gpnf/default.htm
http://genetics.faseb.org/genetics/ashg/policy/rep-01.htm
http://www.cancer.gov/cancerinfo/preventiongenetics-causes
http://www.cancer.gov/cancerinfo/pdq/genetics
http://www.fbr.org/publications/pub_curic.html
http://www.cdc.gov/genomics/training/sixwks.htm
http://www.health.state.ny.us/nysdoh/taskfce/screening.htm
http://www.science.doe.gov/ober/humsubj/resourcebook.htm
http://www.health.state.ny.us/nysdoh/taskfce/screening.htm
http://www.science.doe.gov/ober/humsubj/resourcebook.htm
http://www.ama-assn.org/ama/pub/category/1799.html
http://www.genomenewsnetwork.org/
http://science.bio.org/genomics.news.html
http://www.faseb.org/genetics/abgc/abgcmenu.htm
http://www.faseb.org/genetics/abmg/abmgmenu.htm
http://www.faseb.org/genetics/gsa/gsamenu.htm
http://www.isong.org/support/scope.cfm
http://www.isong.org/about/position.cfm
http://www.ons.org/publications/positions/
http://www.yourcancerrisk.harvard.edu/http://bcra.nci.nih.gov/brc/
http://apps.nccd.cdc.gov/genomics/GDPquerytool/searchbygene.asp
http://www.geneticsresources.org/
http://www.georgetown.edu/research/nrcbl/nirehg/index.htm
http://www.gemdatabase.org/GEMDatabase/index.asp
http://www.gemcris.od.nih.gov/
http://ask.hrsa.gov/ProfessionalPublications.cfm?start=72
http://www.cancer.gov/cancertopics/prevention-geneticscauses/genetics
http://www.niehs.nih.gov/envgenom/home.htm
http://obesityresearch.nih.gov/
http://www.nih.gov/ninr.nih.gov/research/
http://rarediseases.info.nih.gov/
شناسایی منشا پدری کروموزوم 21 اضافی در
سندرم داون با روش های مبتنی بر PCR
کلمات کلیدی: سندرم داون، تریزومی 21، منشا والدی، PCR، مارکرهای میکروستلایت
چکیده
سندرم داون (DS) یکی از فراوان ترین ناهنجاری های کروموزومی در انسان بوده و با عقب افتادگی ذهنی مرتبط است. این سندرم معمولاً در اثر حضور یک کروموزوم 21 اضافی ایجاد می شود. منشا پدری کروموزوم اضافی در بیست خانواده که هر کدام یک فرد مشکوک به سرمنشا بیماری تریزومی 21 داشته اند، بررسی شده است. تریزومی 21 با روش های کروموزومی و مولکولی مورد تأیید قرار گرفته است. بررسی مولکولی روش های مبتنی بر PCR، مارکرهای میکروستلایت چندشکل D21S11 و D21S2055 به ترتیب در 21q21 و 21q22 انجام شده است. فراورده های تکثیر روی ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز شده و پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، آلل ها نمره دهی شدند. سندرم داون یا تریزومی 21 با حضور سه آلل متمایز تشخیص داده شده و انتقال آلل ها از والدین به فرزندان در هر شش خانواده شناسایی گردید. مشخص شده که منشا والدی در نه خانواده، مادری بوده و در پنج خانواده پدری است. میانگین سن مادری و پدری این خانواده ها به ترتیب 29±6.9 و 35±6.9 سال بود. نتایج ما سودمندی استفاده از مارکرهای میکروستلایت با چندشکلی بسیار بالا را برای تشخیص دقیق منشا والدی کروموزوم 21 اضافی در سندرم داون نشان داده و همچنین بر این واقعیت تأکید می کند می کند که تریزومی 21 به واسطه خطاهای میوزی در کروموزوم های مادری ایجاد می شود.
مقدمه
فراوانی تقریبی سندرم داون یا تریزومی 21، یک در 700 تولد زنده بوده است (مولر و یانگ، 1995). این سندرم همراه با عقب افتادگی ذهنی، علایم تأخیر در رشد و اشکالات جسمی است. منشا والدی کروموزوم 21 اضافی تا کنون با روش های رایج شناسایی تنوع های مورفولوژیک در کروموزوم 21 در این خانواده ها بررسی شده است. اما این روش اطلاعات کمتری داده و دقت کمتری داشته و برای شناسایی منشا والدی کروموزوم نمی توان از این روش رایج استفاده کرد (کاروترز، 1987؛ پترسون و همکاران، 1991). از طرف دیگر، ابداع تکنیک های آنالیز شامل مارکرهای میکروستلایت با چندشکلی بالا و واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به تعیین دقیق منشا والدی کروموزوم 21 اضافی کمک می نماید (آنتوناراکیس، 1991؛ پترسون و همکاران، 1991؛ پانگولاس و همکاران، 1992). مزایای اصلی استفاده از مارکرهای چندشکل DNA این است که این مارکرها اطلاعات زیادی را دربرداشته و در طول بازوی بلند کروموزوم 21 پراکنده اند. در نتیجه منشا والدی را می توان با انتخاب مارکرهای مناسبی از منطقه سانترومر یا از منطقه بحرانی سندروم داون (DSCR) یا از منطقه تلومر شناسایی نمود (آنتوناراکیس، 1998). به علاوه، با توجه به راندمان ضعیف دورگه سازی در تکنیک دورگه سازی درجای DNA با پروب های فلورسنت (FISH)، گزارش شده که روش های مبتنی بر PCR می توان روشی جایگزین یا مکمل تکنیک FISH در این مطالعه شناسایی منشا والدی باشد (سامورا و همکاران، 2001). هدف این مطالعه، ارزیابی روش ساده تست DNA مبتنی بر PCR (گوش و دی، 2003) برای شناسایی منشا والدی کروموزوم 21 در سندرم داون است. چنانچه دانش شناسایی منشا والدی، پیش نیازی برای بررسی های عوامل ژنتیکی و محیطی موثر بر فرآیند میوز است.
مواد و روش ها
خانواده ها: در مجموع دوازده خانواده که هر کدام فرزندی داشته اند که با تشخیص کروموزومی مبتلا به تریزومی 21 بوده اند، در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفته اند. در هر خانواده به منظور ارزیابی والدین، افراد مشکوک به سرمنشا بیماری در شجره، خواهران و برادران تنی و خویشاوندان نزدیک بسته به وجود سوژه، تلاشهایی انجام شده است. سن مادر و پدر در زمان تولد فرد سرمنشا بیماری ثبت شده است. خانواده های با بیش از یک فرزند مبتلا به تریزومی 21 در این مطالعه استفاده نشدند. به منظور ارزیابی در خانواده DS1، تنها فرد سرمنشا بیماری در شجره، در دسترس قرار داشته، در حالی که در خانواده های DS11، DS17 و DS20 یکی از والدین در دسترس قرار داشت. در خانواده DS17، یک خویشاوند نزدیک (خواهر مادر، خاله) نیز در کنار فرد سرمنشا بیماری ارزیابی شد.
روش ها: نمونه های خون هپارین دار شده از بخش های اطفال کالج های پزشکی کلکته به منظور کاریوتایپ کردن و تشخیص بیماری دریافت گردید. کشت های لمفوسیت با روش گاسدن و همکاران (1992) و آماده سازی کروموزومی با استفاده از روش هواخشک کردن معمول انجام شد. به منظور انجام آنالیز مولکولی، DNA ژنومی از نمونه های خون افراد سرمنشا بیماری و والدین با استفاده از روش استخراج نمکی میلر و همکاران (1988) استخراج گردید. چندشکلی DNA با استفاده از دو مارکر تترانوکلئوتید D21S11 و D21S2055 که روی کروموزوم 21 و به ترتیب در محل 21q21 و 21q22 قرار دارند، انجام شد. توالی پرایمرها و شرایط PCR بدین ترتیب بوده است:
D21S11:
F-5’GTGAGTCAATTCCCCAAG 3’
R-5’GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC 3’
D21S2055:
F-5’AACAGAAACCAATAGGCTATCTTATC 3’
R-5’TACAGTAAATCACTTGGTAGGAGA 3’
برای پرایمر اول، پس از واسرشت سازی اولیه در 95°C به مدت 5 دقیقه، 30 چرخه تکثیر با 95°C برای 30 ثانیه؛ 60°C به مدت 30 ثانیه؛ 72°C به مدت 30 ثانیه و گسترش نهایی به مدت 9 دقیقه در 72°C انجام شد. برای پرایمر دوم، واسرشت سازی اولیه در 94°C به مدت 3 دقیقه، 30 چرخه تکثیر در 95°C به مدت 30 ثانیه؛ 72°C به مدت یک دقیقه و گسترش نهایی به مدت 3 دقیقه در 72°C انجام شد. واکنش های PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) در یک دستگاه ترمال سایکلر مدل Perkin-Elmer Gene Amp.2400 انجام شد. فرآورده های PCR با روش گوش و دی (2003) آنالیز شدند. بیماران تریزومی 21 سه آلل متمایز داشته و منشا والدی کروموزوم 21 پس از مقایسه باندهای پدر، مادر و فرد بیمار شناسایی گردید.
نتایج
مطالعات سیتوژنتیک:
بررسی کروموزوم ها و کاریوتایپ، تعداد دیپلوئید را در فرد بیمار مورد نظر در تمامی دوازده خانواده 2n = 47, +21 نشان داد. والدین فرد بیمار مورد نظر، تعداد کروموزوم نرمال و کاریوتایپ نرمال نشان می دهند.
مطالعات مولکولی منشا والدی:
آنالیز چندشکلی DNA روی تمامی اعضای خانواده های هسته ای، یک فرد بیمار با تریزومی 21 را دربرمی گیرد. منشا والدی کروموزوم اضافی پس از نمره دهی آلل های چندشکل در یک خانواده تعیین گردید. نتایج حاصل از مطالعات مارکرهای DNA برای تعیین منشا والدی کروموزوم اضافی در جدول 1 خلاصه شده است (مثال های شکل های 1 تا 4 را ببینید).
جدول 1- منشا والدی کروموزوم 21 اضافی در بیماران سندرم داون.
DS-Down syndrome,
از بین 12 خانواده مورد مطالعه، ما می توانستیم منشا والدی را در تمامی خانواده ها شناسایی نماییم. اما این کار در شش خانواده انجام شد. در خانواده DS1، تنها فرد بیمار برای انجام آزمایش در دسترس قرار داشت. در حالی که در خانواده های DS11، DS17 و DS20 پدر و مادر نیز برای انجام مطالعه در دسترس بوده اند (جدول 1). در مورد خانواده DS17، مادر و خواهرش (خاله) ژنوتیپ های یکسانی نشان دادند. در حالی که منشا والدی نامعلوم باقی ماند. در خانواده DS15، منشا آلل 5 در فرد بیمار نامعلوم مانده و به نظر می رسد که پرایمرهای به کار رفته در خانواده های DS15 و DS16 حاوی اطلاعات چندانی نباشند. با این حال، منشا والدی در نه خانواده مادری و در پنج خانواده پدری بوده است. میانگین سن مادر 29± 6.9 و میانگین سن پدر 35±6.9 بوده است. تمامی آلل ها به طور چشمی نمره دهی شده و در محدوده اندازه بین 100 تا 226 جفت باز بوده اند.
بحث
شناسایی منشا والدی کروموزوم اضافی در تریزومی 21 (سندرم داون) برای درک مکانیسم جدانشدن کروموزومی دارای اهمیت بوده و برای توضیح اثر سن مادر نیز سودمند است. این پژوهش نشان می دهد که با استفاده از مارکرهای میکروستلایت D21S11 و D21S2055 منشا کروموزوم اضافی در 45 درصد موارد از تریزومی 21 مادری و در حدود 25 درصد از موارد پدری بوده است. این نتایج با نتایج به دست آمده از مطالعات مولکولی پیشین که در آن جدا نشدن کروموزوم های پدری مسئول تنها حدود 5 تا 6 درصد از موارد تریزومی 21 به حساب آمده بوده اند، تطابق ندارد (آنتوناراکیس، 1991؛ شرمن، 1991؛ کو و همکاران، 1998). همچنین میانگین سن مادر در 20 خانواده دارای بیمار سندروم داون، 29±6.9 سال بوده که تفاوت معنی داری با مقدار 30±5.2 سال که شرمن (1991) گزارش کرده نشان نمی دهد. به هر حال چندین توضیح احتمالی برای تفاوت در نسبت موارد بیماری با منشا پدری وجود دارد. اول این که می توان گفت که نمونه های جمعیت برای آنالیز DNA متفاوت بوده اند. زیرا ما نمونه جمعیت هندی را بررسی کرده ایم. در حالی که داده هایی از نمونه های جمعیت اروپایی و چینی برای مقایسه در دسترس بوده است. دوم این که این اختلاف ممکن است تنها بازتابی از این واقعیت باشد که ما تعداد نسبتاً اندکی از خانواده های دارای بیمار سندرم داون را با استفاده از مارکرهای DNA مورد مطالعه قرار داده ایم و در صورت افزایش حجم داده ها، نسبت موارد بیماری با منشا پدری می تواند افزایش یابد. اما جالب است بدانیم که نقش پدر به عنوان منشا جدا نشدن کروموزوم ها در تریزومی 21 در مطالعه ما تا 25 درصد بوده است. ظاهراً افرادی با تریزومی 21 با منشا پدری از جهت تظاهرات بالینی تفاوتی نسبت به تریزومی 21 با منشا مادری نشان نمی دهند. از طرف دیگر، میانگین سن پدر در این مطالعه 35±6.9 بوده که نسبت به میانگین سن پدر گزارش شده توسط شرمن (1991) و آنتوناراکیس (1991) که به ترتیب 31±4.5 و 31±5.5 بوده، بالاتر بوده است. پیش تر، بلانکو و همکاران (1998) منشا پدری تریزومی 21 را گزارش کرده اند. در حالی که بالستا و همکاران (1998) هیچگونه تفاوت معنی داری بین منشا مادری و پدری کروموزوم اضافی در تریزومی 21 شناسایی نکردند. به هر حال نتایج پژوهش ما با یافته های پیشین که نشان دهنده نقش قابل ملاحظه جدا نشدن کروموزوم های مادری در بیماری زایی تریزومی 21 بوده اند، سازگار است.
روش های جدید تشخیص جنسیت
با ابداع تکنولوژی های جدید در عرصه تولید مثل امکان تشخیص جنسیت یک جنین در حال رشد در رحم یک زن را فراهم شده است. روش های تشخیص پیش از تولد که در دهه 1970 توسعه یافتند، از جمله اولتراسونوگرافی و آمنیوسنتز ثابت شده که در صورت استفاده به عنوان یک روش تشخیص جنسیت سودمند خواهد بود. با استفاده از روش های تشخیص پیش از تولد برای تشخیص جنسیت، فرد می تواند تصمیم بگیرد که فرزندی با جنسیت نامطلوب نداشته باشد و گزینه سقط را انتخاب نماید (1). دسترسی به این روش ها و قابلیت آنها به عنوان ابزاری برای انتخاب جنسیت فرزند به ویژه در جنوب و شرق آسیا به سرعت در حال گسترش است. در حال حاضر از این روش ها در سراسر دنیا به طور گسترده ای استفاده می شود. در جاهایی که این روش ها بیشترین میزان کاربرد را دارند، تشخیص پیش از تولد به منظور انتخاب جنسیت می تواند منجر به عدم تعادل واضحی در نسبت جنسی در جامعه به ویژه بر علیه نوزاد دختر گردد. به عنوان مثال در هند، در سال 2001 بررسی ها نشان داده که تنها طی 10 سال اخیر، نسبت جنسی فرزندان متولد شده از 945 به 927 دختر به ازای هر 1000 پسر کاهش یافته است. در مناطق شهری، این نسبت حتی از این هم شدیدتر بوده و از 935 دختر به ازای هر 1000 پسر به 903 دختر رسیده است (2). در چین نسبت جنسی در هنگام تولد از اواسط دهه 1980 به بعد تنها 100 دختر به ازای هر 107 تا 120 پسر است (3). برای ده ها سال، گروه های مدافع حقوق زنان در این مناطق و نیز گروه های مدافع حقوق معلولین در سراسر جهان به مخالفت با آزادی تبعیض جنسی نهفته در استفاده از این تکنولوژی های جدید پرداخته اند. آنها به دنبال گذراندن لوایح قانونی جهت منع یا محدودیت استفاده از این روش ها بوده و در بسیاری موارد نیز موفق شده اند. اما به واسطه دانش ناکافی و دیدگاه های ضعیف و نیز کاربرد نابجای این روش ها، متأسفانه استفاده گسترده و لجام گسیخته از این تکنیک ها کماکان ادامه دارد.
با وجود چنین شرایطی، در ایالات متحده آمریکا، صنعت قدرتمند تولید مثل (4)، روش های جدیدتری را نیز برای انتخاب جنسیت ابداع کرده و در حال گسترش کاربرد آنهاست. این روش ها شامل جداسازی اسپرم های حاوی کروموزوم X از اسپرم های حاوی کروموزوم Y، و تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت در رحم (PGD) است که هر دوی آنها دارای ارزش افزوده عدم نیاز به سقط هستند که در آمریکا از جهت سیاسی و اجتماعی، موضوعی قابل بحث و چالش برانگیز است. هر دوی این روش ها احتمال داشتن فرزندی با جنسیت دلخواه افزایش می دهند. از آنجا که این روش ها پیش از لقاح تخمک توسط اسپرم (جداسازی اسپرم های حاوی کروموزوم X از اسپرم های حاوی کروموزوم Y) یا پیش از کاشت تخمک لقاح یافته در داخل دیواره رحم زن (PGD) به کار می روند، لذا هیچ یک از این دو روش لزوماً منجر به سقط جنین نخواهد شد. اما چون دقت هیچ یک از این روش ها 100 درصد نیست، برخی زوج هایی که از این روش ها استفاده می کنند، هنوز ممکن است به روشهای تهاجمی تشخیص پیش از تولد (PND) پناه برند که ممکن است همراه با سقط جنین به منظور انتخاب جنس مطلوب باشد. هر دوی روش تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت در رحم (PGD) و جداسازی اسپرم های با کروموزوم جنسی دلخواه نیازمند کاربرد تکنولوژی های پرهزینه کمکی تولیدمثلی (ART) هستند که معمولاً در طب تولیدمثلی (مثل لقاح آزمایشگاهی IVF یا تلقیح مصنوعی AI) از آن استفاده می شود. مجموع هزینه های جداسازی اسپرم های با کروموزوم جنسی دلخواه و تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت در رحم (PGD) بسیار بالاست. به عنوان مثال در سال 2001 زوجهایی که از ریزجداسازی (Microsort) استفاده کرده اند، روشی که در ایالات متحده جهت جداسازی اسپرم های با کروموزوم جنسی دلخواه مجاز شناخته شده، به طور متوسط حدود 10000 دلار پرداخته اند. هزینه های ریزجداسازی 3200 دلار بوده و معمولاً سه دفعه تکرار می شود (5). موافقین انتخاب جنسیت در ایالات متحده استفاده از این تکنیک ها را برای آنچه که آنها "متعادل کردن خانواده" یا "گوناگونی جنسی" می نامند، مجاز می دانند. در آمریکا فرض بر این است که خانواده باید فرزندانی از هر دو جنس داشته باشد. در ایالات متحده، بحث درباره انتخاب جنسیت بیشتر مربوط به کاربرد این تکنیک ها برای حذف دخترها از طریق سقط انتخابی جنین دختر در جوامعی مثل هند و چین که تمایل شدیدی به داشتن فرزند پسر وجود دارد. آنها معتقدند که این اتفاق در ایالات متحده رخ نخواهد داد. اخیراً، آگهی های تجاری انتخاب جنسیت در روزنامه های پرفروش آمریکا مثل نیویورک تایمز (The New York Times) به چاپ رسیده است. جالب این که این آگهی ها اغلب هندی تبارهای آمریکای شمالی و نیز سایر مهاجرین آسیای جنوبی و آسیای شرقی که در آمریکای شمالی زندگی می کنند به طور خاص هدف قرار داده اند (6). به نظر می رسد که فراگیر شدن کاربرد و پذیرش انتخاب جنسیت در ایالات متحده منجر به قانونی شدن کاربرد آن در جاهای دیگر شود. ضروریست که تجویز غیراخلاقی و توسعه بی رویه و نابجای تکنیک انتخاب جنسیت باید مورد تجدید نظر قرار گیرد. به خصوص، هزینه بالای این روش ها، پتانسیل امکان استفاده نابجا، ماهیت روش آزمایشی و همینطور راندمان محدود این روش ها باید مورد بحث قرار گیرد.
انتخاب جنسیت و تبعیض جنسی
فشارهای اقتصادی و اجتماعی برای افزایش تعداد پسرها در ایالات متحده آمریکا ممکن است به اندازه سایر جوامع نباشد، اما به هر حال وجود دارد. تصمیم به داشتن یک فرزند دختر یا پسر بر اساس جایگاه اجتماعی هر جنس در اجتماع شکل می گیرد. ارجحیت پسر یکی از پیامدهای سیستمهای اجتماعی مردسالار است که در سراسر جهان به چشم می خورد. متأسفانه این طرز انتخاب یک ویژگی منحصر به فرد شدیداً زیان بخش برای اجتماع است که به فرزند پسر ارزش بیشتری قایل بوده معمولاً با بی توجهی و مراقبت ناکافی از فرزندان دختر همراه است. از نظر سابقه تاریخی نیز، تخریب شخصیت دختران به شکل های مختلف ابراز شده که از کشتن دختران تا عدم تغذیه و مراقبت از سلامت دختران پس از تولد متفاوت است. به دنبال پیشرفت هایی که در تکنولوژی تولیدمثلی به دست آمده، تشخیص پیش از تولد که پس از آن به منظور انتخاب جنسیت سقط جنین تجویز گردد، نیز به این فهرست استفاده نابجا از تکنولوژی افزوده شده است. خشونت علیه دختران و زنان اغلب به شکل محرومیت و بی توجهی بروز می کند. اما تغییر شکل خشونت های خانوادگی می تواند به کنترل ظرفیت تولیدمثلی زن نیز منجر شود.
در جنوب آسیا، تولد یک فرزند پسر جایگاه زن را در خانواده تقویت نموده در حالی که ناتوانی زن در به دنیا آوردن یک فرزند پسر می تواند منجر به سرافکندگی، تحقیر، بی احترامی، خشونت و بدرفتاری با او در خانواده و در نهایت متارکه گردد. مردها اغلب همسران خود را سرزنش می کنند که چرا برایشان پسر به دنیا نیاورده اند. در شرایط سخت و خشونت بار به وجود آمده، زن ممکن است مجبور شود به آزمایشاتی تن دردهد تا جنسیت فرزند آینده اش مشخص شده و سپس در صورت دختر بودن جنین مجبور به سقط آن گردد. زنان ممکن است به دلیل به دنیا نیاوردن پسر مورد کتک کاری قرار گرفته و یا حتی طلاق داده شوند. یک همسر خشن ممکن است تولدیک دختر را دستاویزی برای رفتار خشونت آمیز با همسرش قرار داده و حتی بعداً نسبت به فرزند دختر ناخواسته اش نیز رفتار خشونت باری داشته باشد. اینگونه خشونت ها در ایالات متحده آمریکا نیز رخ می دهد.
انتخاب جنسیت یک تجارت بزرگ است
از آنجا که تکنیک های انتخاب جنسیت نیازمند استفاده از تکنولوژی های کمکی تولیدمثل (ART) هستند (7) (همانند لقاح آزمایشگاهی (IVF) و تلقیح مصنوعی (IA) و غیره)، طب تولیدمثل می تواند از انتخاب جنسیت به منظور گسترش بازار کار خود برای زوج های بارور نیز استفاده نماید. مجله فورچیون (Fortune) تخمین می زند که بازار این تجارت بین 200 تا 400 میلیون دلار در سال برای روش جداسازی اسپرم های حاوی کروموزوم X و Y (ریزجداسازی) (8). باوجود قیمت بسیار بالا، تهاجمی بودن تکنیک و خطرات احتمالی، تقاضا برای این روش ها در حال افزایش است. بررسی نشان داده است که بین 25 تا 35 درصد از تمامی والدین در ایالات متحده در صورت امکان تمایل به استفاده از روش های انتخاب جنسیت جنین خود دارند (9). شرکت های آمریکایی تاکنون سود بسیار زیادی را تنها از بازار جنوب آسیا به دست آورده اند. به عنوان مثال صنعت الکتریک عمومی (GE) بیشترین سهم بازار را جهت اسکنر های اولتراسوند در هند به دست آورده است. این صنعت تعدادی بی حساب و نامتناسبی از این دستگاه ها را در شمال غربی هند، جایی که نسبت جنسی دختر به پسر در آن کمترین مقدار است، به فروش رسانده است (11). یک شرکت آمریکایی دیگر (Gen-Select)، جدیداً کیت های تعیین جنسیت کذایی خود را در نشریه تایمز هند (Times of India) به فروش رسانده است (12).
تکنولوژی های جدید تولیدمثلی که در انتخاب جنسیت به کار می روند عبارتند از:
1. تشخیص پیش از تولد (PND)
PND که در دهه 1970 ابداع شده، در بین تکنیک هایی مثل اولتراسونوگرافی و آمنیوسنتز که پس از آن سقط به منظور انتخاب جنسیت دلخواه انجام می شود، کماکان به عنوان رایج ترین روش انتخاب جنسیت شناخته شده و در سراسر جهان مدت سه دهه است که مورد استفاده قرار گرفته است.
2. تشخیص ژنتیکی پیش از کاشت در رحم (PGD)
این روش اولین بار در سال 1990 برای انسان مورد استفاده قرار گرفته و کاربرد آن طی پنج سال اخیر عمدتاً توسط زوج های ناباروری که به لقاح آزمایشگاهی (IVF) تن در داده و در عین حال خطر داشتن فرزندی با بیماری ژنتیکی خاص در آنها بالاست، رو به گسترش است. پس از بارور شدن تخمک های زن با اسپرم مرد در آزمایشگاه آزمایشات ژنتیکی بر روی رویان های حاصل (تخمک های لقاح یافته) انجام می گیرد تا جنسیت شان معلوم گردد. تنها رویان های با جنسیت دلخواه در رحم زن کاشته می شوند. نگرانی طرفداران حقوق معلولین درباره این که آیا باید خطی برای کاربردهای قابل قبول و غیرقابل قبول روش PGD کشید و این که این خط کجاست در حال افزایش است. روش PGD برای غربالگری جنین های دارای ژن مارکر مرتبط با کری در نسل های آتی فرزندان به کار رفته است (13). آیا PGD برای غربالگری رنگ دلخواه مو و چشم نیز به کار خواهد رفت؟ این پیامدهای انتخاب جنسیت به شدت در ارتباط با شکل های مختلف رفتار خشونت بار با زنان بوده و نه تنها به جنسیت مربوط بوده بلکه به نژاد، توان مالی و طبقه اجتماعی نیز وابسته است. از آنجا که این یک روش آزمایشگاهی است، معلوم نیست که آیا فرآیند حذف یک سلول از جنین به منظور انجام آزمایشات ژنتیکی می تواند منجر به پیامدهای درازمدتی برای سلامتی فرزند حاصل شود (14). برای زنان، IVF فرآیندی آزاردهنده است که ممکن است مجبور شود تا پیش از یک بارداری موفق، چند بار به آن تن دردهد (15). خطرات این کار شامل سندروم بیش تحریکی تخمدان، یک وضعیت بالقوه تحدیدکننده زندگی و نیز تولد چندقلویی است (16). مطالعات اخیر نیز نشان می دهد که نوزادانی که از طریق IVF به وجود آمده اند خطر وزن تولد پایین و ناهنجاری های مادرزادی بیش از باروری های طبیعی است (17).
3. جداسازی اسپرم های حاوی کروموزوم X و Y
از آنجا که کروموزوم جنسی اسپرم مرد است که جنسیت فرزند را تعیین می کند، جداسازی اسپرم های حاوی کروموزوم جنسی نر و ماده، یکی از روش های انتخاب جنسیت است. این یک روش انتخاب جنسیت پیش از لقاح است. زیرا پیش از بارور شدن تخمک زن با اسپرم، انجام می شود که با تلقیح مصنوعی یا IVF همراه است. در حال حاضر دو روش برای جداسازی اسپرم ها وجود دارد که در اصل برای بارور نمودن حیوانات اهلی با یک جنس خاص ابداع شده اند. از آنجا که هر دوی این روش ها در حال حاض برای استفاده برای انسان در حال ارزیابی است، خطراتی که ممکن است برای سلامت فرد داشته باشد به طور کامل شناخته نشده است. هنگام کاربرد همزمان جداسازی اسپرم و IVF، خطرات مرتبط با آن را باید دوباره محاسبه و بررسی نمود. تکنیک های جداسازی اسپرم هنوز قابل اطمینان نیستند. به عنوان مثال ریزجداسازی اسپرم، به طور میانگین میزان خلوص 88 درصد برای اسپرم حاوی کروموزوم X و 66 درصد برای اسپرم های حاوی کروموزوم Y بوده که در 916 مورد آزمایش جداسازی اسپرم بین ژوئن 1994 و آوریل 2000 انجام شده، به دست آمده است (18).
شرایط قانونی برای انتخاب جنسیت در برخی کشورها بدین ترتیب است:
در انگلیس، قوانین سختی توسط انجمن جنین شناسی و باروری انسانی (HFEA) برای کاربرد PGD وجود دارد. HFEA اخیراً یک مشاوره عمومی برای تصمیم گیری درباره مجاز شمردن جداسازی اسپرم های دارای کروموزوم X و Y برگزار نموده است.
انجمن قوانین حقوق بشر و پزشکی اروپا در مقاله 14 خود می گوید: استفاده از تکنیک های پزشکی در زاد و ولد نباید به منظور انتخاب جنسیت فرزند آینده به کار رود مگر در جایی که به منظور اجتناب از بیماری های وابسته به جنس ارثی شدید به کار رود (19).
در کانادا قانونی در ماه می سال 2002 تصویب شده که انتخاب جنسیت را به منظوری غیر از پیشگیری، تشخیص و درمان بیماری ها یا ناهنجاری های ژنتیکی وابسته به جنس، جرم محسوب می کند (29).
در هند، کاربرد PND، PGD و تکنیک های پیش از لقاح از قبیل جداسازی اسپرم های حاوی کروموزوم X و Y به منظور انتخاب جنسیت، همگی توسط قانون منع انتخاب و تعیین جنسیت پیش از لقاح و پیش از تولد در سال 2001، قدغن شده اند.
در چین یک قانون در مارس 2003 برای منع تشخیص پیش از تولد برای انتخاب جنس تصویب گردید.
در ایالات متحده آمریکا، در حال حاضر قوانین اندکی در حوضه طب باروری وجود دارد. انجمن پزشکی تولیدمثل آمریکا (ASRM) یک انجمن سنتی است که توصیه هایی را جهت کاربرد اخلاقی این تکنولوژی ها ارایه می دهد. اما کلینیک ها ملزم به پیروی از آن نیستند. ASRM کتابچه های راهنمایی را در سال 2001 منتشر نموده که جداسازی اسپرم در برخی شرایط خاص را از نظر اخلاقی مجاز می شمارد. انجمن ASRM در سال گذشته توصیه های خود را درباره استفاده از PGD به منظور انتخاب جنسیت بیان نموده است. در عوض، کلینیک های باروری ایالات متحده آمریکا، از جمله کلینیک پزشکی تیلور در لس آنجلس و انستیتو پزشکی تولیدمثل "شر" در لاسوگاس روش PGD را جهت انتخاب جنسیت انجام داده و آن را تبلیغ می کنند (20).